[發明專利]一種乙草胺檢測酶聯免疫試劑盒

有效

• 申請號: 201710249637.8
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN106841598B
• 公開（公告）日: 2019-02-19
• 發明（設計）人: 何艷平;徐毓琴;蒲小容;石潔;郭艷琴
• 申請（專利權）人: 四川精衛食品檢測科技有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/535
• 代理公司: 成都睿道專利代理事務所(普通合伙) 51217
• 代理人: 趙云

1.一種乙草胺檢測酶聯免疫試劑盒，其特征在于：包括酶標板、酶標記物工作液、乙草胺特異性抗體濃縮液、洗滌工作液、復溶工作液和TMB顯色液，其中，所述酶標板的微孔條上預包被乙草胺偶聯抗原，所述酶標記物工作液為酶標記抗抗體工作液，具體為：

(1)洗滌工作液，濃縮洗滌液1：19體積比稀釋而成，所述濃縮洗滌液為pH值為7.1～7.5，含有0.8％～1.2％吐溫-20、0.01％～0.03％硫柳汞防腐劑、0.01～0.03mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；

(2)復溶工作液，濃縮復溶液1：1體積比稀釋而成，pH值為7.2～7.7，含有8％～12％卵清蛋白、0.1～0.4mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；

(3)TMB顯色液，包括TMB底物液A液和TMB底物液B液，A液為過氧化氫，B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺；

(4)終止液，0.5mol/L的鹽酸緩沖液；

(5)酶標板為96孔酶標板，其中在酶標板制備過程中所用的包被緩沖液為pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為pH值為9.1～9.5，含有3％～10％小牛血清、0.2％吐溫-20、0.1～0.3mol/L的碳酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；酶標板的制備過程為，用包被緩沖液將包被原稀釋成0.1～0.2μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h或4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封閉液37℃溫育1～2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜真空；

(6)其中，乙草胺特異性抗體的制備流程為：將這兩種抗原注入到小鼠進行免疫反應，最終得到兩種針對不同乙草胺結構的抗體；

乙草胺抗原1的合成方法是：乙草胺溶于甲氫呋喃中，氮氣保護下加熱攪拌加入巰基丙酸，K2CO3做催化劑，用TLC薄層板監測反應進行，直至沒有原料或原料點很淺，停止反應，凈化，甲醇重結晶，得水解產物；

稱取30mg半抗原溶解于2mLDMF溶液中，加入各溶于2mL水中的60mgEDC和NHS進行活化30分鐘，加入到溶于5mL水中的110-264mg載體蛋白BSA進行偶聯制備出免疫原，用0.02mol/LPB緩沖液透析3天，每天早晚更換透析液，透析完成后用于動物免疫制備出抗體；

乙草胺抗原2的合成方法是：將1.5g乙草胺加入到濃硫酸與濃硝酸的混酸中，濃硫酸與濃硝酸體積比為v/v＝30/70,室溫下攪拌反應，反應完全后，加入氫氧化鈉調pH至中性，抽濾水洗，干燥得反應產物1.45g，將產物溶于甲醇中，通入氫氣，加入0.1鈀-碳催化反應，反應完成后抽濾濃縮得產物1.3g，產物1.3g溶于干燥四氫呋喃溶液中，加入0.5g丁二酸酐，0.1gDMAP(4-二甲氨基吡啶)作催化劑進行反應，反應完成后，提純最終得半抗原；稱取以上半抗原0.1g，分別溶解于3mLN,N-二甲基甲酰胺溶液，分別加入NHS(N-羥基丁二酰亞胺)/EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)混合水溶液，活化4小時；活化后溶液分別加入到含有BSA(牛血清白蛋白)220mg的BSA溶液中，調pH8.5，室溫反應24小時，轉到透析袋中于0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶液中透析3天，每天早晚換液；

上述得到的兩種抗原，將如下兩種抗原注入到小鼠/兔子進行免疫反應，最終得到兩種針對不同乙草胺結構的抗體；

(7)酶標二抗工作液，本實施例酶標二抗采用羊抗鼠抗抗體，以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原，對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體；酶標二抗通過稀釋，酶標二抗得到工作液；

(8)乙草胺標準溶液，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L和40.5μg/L；其中標準品稀釋液為PH值7.4的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。