[發(fā)明專利]一種基于編碼多重PCR產(chǎn)物的焦測序分析方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710249100.1
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN106929589A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖鵬峰;魏榮斌
• 申請（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32204
• 代理人: 柏尚春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種多重PCR產(chǎn)物的定性、定量檢測方法，具體涉及一種編碼多重PCR的引物、繼而編碼引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物、并最終通過焦測序解碼相應(yīng)的PCR產(chǎn)物是否存在的分析技術(shù)。

背景技術(shù)

隨著社會的進(jìn)步、人們生活水平的提高，人們對食品安全、醫(yī)療衛(wèi)生的意識和要求越來越高。如何在食品安全檢測中，引起人類疾病和食物中毒的致病性微生物(如：沙門氏菌、葡萄球菌、鏈球菌、副溶血性弧菌、變形桿菌、志賀氏菌、禽流感病毒、黃曲霉菌及病毒、口蹄疫病毒等)多種多樣，這些食品安全檢測可能涉及幾十種甚至更多種類的微生物鑒定，但一般情況下一種食品只可能存在幾種或者沒有受到污染，如何快速對對食品的安全進(jìn)行準(zhǔn)確的檢測對避免惡性事件發(fā)生，以及對惡性事件后續(xù)應(yīng)急處理、越少對社會的負(fù)面影響無疑具有重要的意義。又如在疾病診斷和治療中，對病毒性肝炎、人乳頭瘤病毒等感染性疾病的診斷，其基因分型也可能涉及上百種類型，但到具體的某個患者則可能只有一種特定的基因型。如何快速、準(zhǔn)確、便宜地實(shí)現(xiàn)這些傳染性疾病的診斷，為對患者贏得治療的寶貴時間、實(shí)施正確的治療方式、降低患者的醫(yī)療費(fèi)用具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。上述檢測均涉及到核酸分子的檢測，即從多個可能的候選特征DNA序列中找出樣品中真實(shí)存在的特征DNA模板序列。

多重PCR技術(shù)為不同DNA模板擴(kuò)增提供了一種快速可行途徑，多重PCR可以在同一反應(yīng)體系中獲得不同DNA模板，只要能夠?qū)@些不同DNA模板一一實(shí)施分析，就能夠?qū)崿F(xiàn)多組分的檢測。然而，基于凝膠電泳分析多重PCR產(chǎn)物的方法依賴于PCR產(chǎn)物的，只有不同的PCR產(chǎn)物長度區(qū)分很明顯的情況下(一般兩個PCR片段相對大小需要相差幾十個堿基)才可能做出正確的判斷，因此凝膠電泳的分辨力不高造成了這種價格便宜的分析方法并不能滿足快速檢測于診斷的需求。因此，發(fā)展一種能夠準(zhǔn)確分析這些多重不同PCR產(chǎn)物具有現(xiàn)實(shí)意義。

美國應(yīng)用生物公司開發(fā)出一種分析多個PCR產(chǎn)物中SNP位點(diǎn)的方法： 多重分析試劑盒。利用不同長度延伸引物與包含多個SNP位點(diǎn)得PCR產(chǎn)物雜交后、延伸四種熒光標(biāo)記的ddNTP，并經(jīng)類似于Sanger測序分析后，根 據(jù)針對每個位點(diǎn)設(shè)計(jì)的特定長度的延伸引物峰顏色可以實(shí)現(xiàn)每個SNP位點(diǎn)得分型。在這一分析方法中，特定長度的延伸引物可以視為編碼，一個特定長度的延伸引物對應(yīng)一個SNP位點(diǎn)。這一方法能夠同時分析多重PCR產(chǎn)物，具有快速、準(zhǔn)確、價格相對低廉的特征。然而，Sanger毛細(xì)管測序儀被美國ThermoFisher公司旗下的Life部門具有壟斷優(yōu)勢，價格昂貴，其分析成本居高不下，不容易推廣；且Sanger測序只能提供定性分析，最大得不足是由于四種染料基線噪音得影響，對于含量低于10％的PCR產(chǎn)物的連定性分析也無能為力。

焦測序技術(shù)(Pyrosequencing，又稱焦磷酸測序技術(shù))是繼Sanger測序后的一代測序技術(shù)。相對于Sanger測序，除了測序長度處于弱勢外，其測序準(zhǔn)確度與之相當(dāng)、但在自動化程度，操作簡易、價格上均有優(yōu)勢、且檢測限更低和具有定量功能，容易推廣、十分適合臨床檢測上使用。然而，焦測序技術(shù)并不具備Sanger測序能夠分析部分封閉的標(biāo)記不同長度的測序引物延伸片段，類似于編碼技術(shù)并不適合分析多重PCR產(chǎn)物是混合產(chǎn)物，因?yàn)樵诮箿y序解碼時會因不同PCR產(chǎn)物測序信息的干擾而無法獲得單個PCR產(chǎn)物的信息。然而，如果不像Sanger測序采用的部分封閉，而是完全封閉的方式，那么每當(dāng)編碼堿基被測序解碼后，其延伸引物被完全封閉、不再繼續(xù)參與任何核苷酸加入的測序反應(yīng)，即對后續(xù)的解碼測序反應(yīng)無影響。但按照一般的全編碼方式，最多也就只能對四種不同的堿基進(jìn)行一次編碼、獲得四個不同的編碼。這無疑限制了編碼數(shù)目，使得分析的對象也受限于最多4個。如果四個不同的堿基采用不是全編碼，而是部分堿基編碼，雖然在同一位置編碼數(shù)目小于4個，但可以利用多個位置進(jìn)行編碼，這樣就能提升編碼的數(shù)目、且用于編碼引物序列的堿基數(shù)目越多，編碼的數(shù)目也就越多。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種基于編碼多重PCR產(chǎn)物的焦測序分析方法。該方法是對多重PCR產(chǎn)物的定性、定量檢測方法，尤其可以對PCR產(chǎn)物中多個PCR產(chǎn)物同時存在的情況進(jìn)行檢測。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述目的，如本發(fā)明所述一種基于編碼多重PCR產(chǎn)物的焦測序分析方法，包括如下步驟：

(1)提取血液、唾液等樣本的基因組DNA；

(2)以樣本的基因組DNA為模板通過編碼引物的多重PCR擴(kuò)增，獲得含有待分析的目的片段的PCR產(chǎn)物；