[發明專利]一種基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法

在審

• 申請號: 201710249100.1
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN106929589A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 肖鵬峰;魏榮斌
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)32204
• 代理人: 柏尚春

1.一種基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取樣本的基因組DNA；

(2)以樣本的基因組DNA為模板通過編碼引物的多重PCR擴增，獲得含有待分析的目的片段的PCR產物；

(3)將步驟(2)獲得PCR產物制備成單鏈PCR產物，焦測序分析單鏈PCR產物的編碼引物中編碼區域的序列信息；

(4)根據焦測序列結果，確定編碼對應的PCR產物是否存在，實現該PCR產物特征DNA序列的檢測。

2.根據權利要1所述的基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法，其特征在于，步驟(2)所述編碼引物是指擴增一個待分析目的片段的兩個PCR引物中一個被編碼的引物，且一個編碼對應一個PCR產物；另一個PCR引物為未編碼引物。

3.根據權利要求1或2所述的基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法，其特征在于，所述編碼引物由三部分區域序列組成，即特異雜交區域序列、編碼區域序列和通用區域序列；所述特異雜交區域序列用作特定PCR引物；所述編碼區域序列用于標記定PCR產物；所述通用區域序列用于焦測序分析編碼區域序列的測序引物雜交區域。

4.根據權利要求3所述的基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法，其特征在于，所述編碼區域序列由1個編碼堿基和若干個路徑堿基構成，其中位于編碼區域序列中3’末端最后一個堿基用于編碼，稱為編碼堿基，序列其余堿基稱為路徑堿基。

5.根據權利要求3所述的基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法，其特征在于，所述編碼引物的特異雜交區域序列為待分析目的片段，是表征待分析對象的一段特征序列、具有唯一性。

6.根據權利要求1或2所述的基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法，其特征在于，所述一個編碼引物的目的片段代表一個待分析對象，編碼引物至少為2個，即至少待分析的對象為2個，構成多重PCR，編碼引物優選為10～20個。

7.根據權利要求2所述的基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法，其特征在于，所述兩個PCR引物中另一個未編碼引物的5’端被生物素修飾；所述未編碼引物可以與一個編碼引物構成擴增一個待分析目的片段的兩個PCR引物，也可以作為多個編碼引物公用的另一個引物。

8.根據權利要1所述的基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法，其特征在于，步驟(3)的具體步驟為：

(3-1)制備單鏈PCR產物的DNA模板：將步驟(2)獲得PCR擴增產物與鏈霉親和素包裹的磁珠反應，由5’端被生物素修飾的未編碼引物擴增PCR產物DNA鏈固定到所述磁珠上，得到單鏈PCR產物的DNA模板；

(3-2)測序引物雜交：將合成的測序引物與單鏈PCR產物的DNA模板結合；所述測序引物為焦測序引物，它的序列與編碼引物中通用區域序列完全相同；

(3-3)根據編碼區域序列設計核苷酸加入順序進行焦測序分析。

9.根據權利要8所述的基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法，其特征在于，步驟(3-3)所述編碼區域序列中的編碼堿基的信息是加入單個ddNTP來實現解碼的；路徑堿基信息是通過加入單個dNTP測序實現的，當一個編碼區域序列的編碼堿基被測序完成后，這個編碼區域序列的后續堿基因測序引物被封閉，不在提供測序信息，按照核苷酸加入得順序，依次解碼，當路徑堿基無測序信息時，表明后續編碼區域序列無PCR產物，停止測序反應。

10.根據權利要1所述的基于編碼多重PCR產物的焦測序分析方法，其特征在于，步驟(4)所述根據焦測序列結果，若加入的ddNTP有明顯的測序信號，則表明該編碼引物序列的PCR產物是存在的，表明樣本中含有該PCR產物的特征DNA序列；若果加入的ddNTP無明顯的測序信號，則表明該編碼引物序列的PCR產物是不存在的，表明樣本中不含有該PCR產物的特征DNA序列。