[發明專利]對昆蟲蛋白或昆蟲表達系統表達的外源蛋白進行標記的方法

有效

• 申請號: 201710248915.8
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN108728397B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發明（設計）人: 李學兵;張振寧;傅立峰
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12N15/866;C07K14/435;G01N33/68
• 代理公司: 北京信慧永光知識產權代理有限責任公司 11290
• 代理人: 朱學珺;董世豪

本發明涉及一種對昆蟲來源的蛋白進行標記的方法。所述方法借助昆蟲自身代謝通路將疊氮修飾的全乙酰化N?乙酰氨基葡萄糖摻入至昆蟲表達的蛋白的糖基，隨后通過點擊化學反應，將可檢測標記物偶聯至蛋白，從而實現對昆蟲來源的蛋白的標記。所述方法可用于原位標記昆蟲細胞或標記昆蟲表達系統所表達的外源蛋白。

技術領域

本發明涉及通過生物正交反應對昆蟲來源的蛋白進行標記的方法。該方法可實現昆蟲細胞中的蛋白的原位標記，也可實現對昆蟲桿狀病毒表達系統所表達的外源蛋白進行標記。

背景技術

蛋白是細胞內最豐富的生物大分子，它幾乎參與所有的生命過程。因此，對蛋白的結構、功能和相互作用的研究是生命科學領域的一項重要任務。在很多情況下，需要對蛋白進行標記來實現實時和/或定量的觀測。目前最常用的標記蛋白的方法包括熒光蛋白(fluorescent protein)、放射性同位素以及通過化學反應將熒光基團非特異性地修飾至蛋白中的賴氨酸或酪氨酸。然而，這些方法往往操作復雜，還可能對蛋白的結構、功能和定位產生影響。針對傳統方法的上述缺陷，近十幾年來發展的生物正交反應為蛋白的標記或修飾提供了新的可能。

生物正交反應是指具有如下特征的化學反應：在生理條件下進行，不干擾同時發生的其它生化反應或各種生物內源過程，且不會對生物體及生物內源分子造成損傷。就借助生物正交反應實現蛋白標記而言，首先將生物正交反應基團引入蛋白，借助該正交反應基團與帶有互補反應基團的標記物進行反應，將不同的標記物(例如熒光或免疫印跡標記物)偶聯至蛋白，從而實現蛋白定位和功能的檢測。目前最常用的生物正交反應基團對包括能夠發生點擊化學(Click Chemistry)反應的疊氮基-炔基以及疊氮基-三芳基膦。其中，疊氮基與三芳基膦發生的施陶丁格反應(Staudinger Ligation)或與炔基發生的環加成反應均能將與該生物正交反應基團對中的一個成員相連的蛋白偶聯至與該生物正交反應基團對中的另一成員相連的可檢測標記物，實現將可檢測標記物修飾至蛋白的目的。其中，疊氮基團與高張力炔烴的環加成反應(Strain-promoted azide-alkyne cycloaddition，SPAAC)因其不需要添加催化劑而成為研究和應用熱點。

最近發展了借助生物糖代謝途徑將化學探針引入蛋白的策略。其以化學生物學方法為切入點，通過對非天然糖進行設計，在蛋白的糖鏈中引入生物正交反應基團，并借助生理條件下的生物正交反應引入探針分子。該方法能夠在分子水平上揭示糖蛋白的定位與功能。然而，這種方法多用于哺乳動物細胞蛋白的標記。目前還未有利用非天然糖的生物正交反應對昆蟲細胞或昆蟲表達系統表達的蛋白進行標記的報道。

昆蟲桿狀病毒表達系統(Baculovirus Expression Vector Systems，BEVS)是目前應用廣泛的蛋白表達體系，具有效率高、周期短、成本低等優點。此外，宿主昆蟲細胞能夠以多種復雜方式對合成的蛋白進行翻譯后修飾，表達的重組蛋白在細胞內被折疊、修飾、運輸、組裝成最終的功能蛋白。其中，蛋白N-糖基化修飾是昆蟲桿狀病毒表達系統的重要特征，這對很多蛋白的正確折疊和發揮生物功能具有重要意義。然而，目前對昆蟲蛋白進行標記的方法極少。最近報道了通過對宿主細胞進行遺傳工程操作，使得宿主細胞能夠表達將帶有生物正交基團的非天然氨基酸插入肽鏈的氨酰tRNA合成酶；進而對目的蛋白的編碼序列進行改造，將特定位點的核苷酸序列突變為琥珀終止子(UAG)，從而將該非天然氨基酸插入到目標蛋白的該特定位點，由此實現利用該非天然氨基酸對目標蛋白進行標記。然而，該方法操作復雜，實施周期長，不利于推廣。

因此，仍存在對用于昆蟲細胞和昆蟲桿狀病毒表達系統表達的蛋白進行標記的簡捷方法的需求。

發明內容

針對本領域的上述問題，一方面，本發明提供了一種對昆蟲細胞中的糖蛋白進行原位標記的方法，所述方法包含如下步驟：

(i)在昆蟲細胞培養基中添加疊氮修飾的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，將昆蟲細胞接種入所述培養基中并對所述昆蟲細胞進行培養，得到細胞懸液；