[發明專利]對昆蟲蛋白或昆蟲表達系統表達的外源蛋白進行標記的方法

有效

• 申請號: 201710248915.8
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN108728397B
• 公開（公告）日: 2022-05-20
• 發明（設計）人: 李學兵;張振寧;傅立峰
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12N15/866;C07K14/435;G01N33/68
• 代理公司: 北京信慧永光知識產權代理有限責任公司 11290
• 代理人: 朱學珺;董世豪

1.一種對昆蟲細胞中糖蛋白進行原位標記的方法，所述方法包含如下步驟：

（i）在昆蟲細胞培養基中添加疊氮修飾的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖，將昆蟲細胞接種入所述培養基中并對所述昆蟲細胞進行培養，得到細胞懸液，其中，所述疊氮修飾的全乙酰化N-乙酰氨基葡萄糖為1,3,4,6-四-O-乙酰基-N-疊氮乙酰氨基葡萄糖；

（ii）收集步驟（i）得到的細胞懸液，離心，得到所述細胞的沉淀；

（iii）對步驟（ii）獲得的所述沉淀中的細胞進行固定；

（iv）向步驟（iii）的經固定的細胞中添加連接有炔基或三芳基膦的可檢測標記物，從而將所述可檢測標記物偶聯至所述細胞內的糖蛋白；

（v）對所述可檢測標記物進行檢測。

2.如權利要求1所述的方法，其中，步驟（iv）中，所述連接有炔基的可檢測標記物選自于由如下物質所組成的組：

式（II-1），

式（II-2），

式（II-3），

式（II-4），和

式（II-5）；

其中，所述連接有三芳基膦的可檢測標記物選自于由如下物質所組成的組：

式（II-6）

其中，所述是直接或間接連接至炔基部分或三芳基膦部分的可檢測標記物。

3.如權利要求1或2所述的方法，其中，步驟（iv）中，所述可檢測標記物選自于由如下物質所組成的組：放射性同位素、發色團、抗體、化學發光化合物、光譜比色標記物、熒光化合物、金屬螯合物和酶。

4.如權利要求3所述的方法，其中，所述放射性同位素選自于由如下物質所組成的組：

³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C、³²P和³³P。

5.如權利要求3所述的方法，其中，所述熒光化合物選自于由如下物質所組成的組：

熒光素、羅丹明或羅丹明衍生物、青色素染料、香豆素。

6.如權利要求5所述的方法，其中，所述熒光素選自6-羧基熒光素、6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基熒光素、異硫氰酸熒光素。

7.如權利要求5所述的方法，其中，所述羅丹明衍生物選自N,N,N’,N’-四甲基-6羧基羅丹明、6-羧基-X-羅丹明、5-羧基羅丹明-6G、6-羧基羅丹明-6G、羅丹明110、四羅丹明異硫氰酸酯。

8.如權利要求5所述的方法，其中，所述青色素染料選自Cy3、Cy5和Cy7染料。

9.如權利要求5所述的方法，其中，所述香豆素為傘形酮。

10.如權利要求3所述的方法，其中，所述酶選自于螢火蟲螢光素酶、海腎螢光素酶。

11.如權利要求3所述的方法，其中，所述酶選自于由如下物質所組成的組：

蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-類固醇異源性酶、酵母醇脫氫酶、α-磷酸甘油脫氫酶、磷酸丙糖異構酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-VI-磷酸脫氫酶、葡萄糖淀粉酶和乙酰膽堿酯酶。

12.如權利要求3所述的方法，其中，所述化學發光化合物選自于由如下物質所組成的組：

光澤精、魯米諾、（金剛烷）-1,2-二氧乙烷、異魯米諾、咪唑、吖啶酯、吖啶酰胺、三聯吡啶釕和草酸酯。

13.如權利要求3所述的方法，其中，所述光譜比色標記物選自于由如下物質所組成的組：

膠體金或者有色玻璃或塑料珠。