[發明專利]犬瘟熱病毒敏感細胞系SLAM-MDCK及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201710248897.3
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN107164409B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 韓麗;李文珂;張安定
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66;C12N15/12;C12N5/10;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平;馮超

本發明公開了一種犬瘟熱病毒敏感細胞系SLAM?MDCK及其構建方法和應用。本發明通過將犬源信號淋巴激活分子(SLAM)通過逆轉錄病毒載體構建到MDCK細胞中，構建了穩定表達犬SLAM基因的MDCK細胞SLAM?MDCK。犬瘟熱病毒感染SLAM?MDCK細胞系后，產生的病變快、增殖滴度高，適合犬瘟熱病毒的分離和培養。因此，該細胞系在犬瘟熱病毒的分離、感染犬瘟熱的確診、以及犬瘟熱病毒疫苗的研制和生產中具有重要意義。

技術領域

本發明涉及細胞系領域，具體地指一種犬瘟熱病毒敏感細胞系 SLAM-MDCK及其構建方法和應用。

背景技術

犬瘟熱(Canine distemper，CD)是由副粘病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)感染犬所引起的急性、熱性及高度接觸性的一種烈性傳染病。主要臨床特征是雙相熱，眼、鼻、消化道等處粘膜炎癥，以及卡他性肺炎、皮炎及神經癥狀。自1809年首次報道以來，該病呈現了全球范圍內流行的趨勢，給伴侶動物與野生動物造成了嚴重影響。CDV分為亞洲Ⅰ型(Asia-Ⅰ)、亞洲Ⅱ型(Asia-Ⅱ)、歐洲型(Europe)、美洲Ⅱ型(America-Ⅱ)、北極型(Arctic)和疫苗型(Vaccine)6個不同的基因型，但公認只有一個血清型。

CDV的自然感染宿主十分廣泛，并且呈現不斷擴大的趨勢。已由傳統的犬科、鼬科及浣熊科擴展到了食肉目的所有8個科，以及偶蹄目豬科、靈長目的獼猴屬和鰭足目海豹科等多種動物。

病毒的分離鑒定對于疫病的確診以及掌握病毒的變異和流行情況具有非常重要的意義。雖然CDV具有囊膜，但結構易脆，對環境的抵抗力非常弱，易被光和熱滅活，對乙醚、氯仿、甲醛等有機溶劑敏感，導致分離CDV的成功率很低。目前該病毒的分離多采用犬腎細胞系(MDCK)、非洲綠猴腎細胞系(Vero)及絨猴淋巴細胞系(B95 α)等傳代細胞系。使用MDCK分離野毒株時病毒所形成的細胞病變不明顯且形成時間較長，而Vero分離病毒的成功率不高且會導致病毒毒力下降。B95α雖然分離的成功率較高，但利用其分離到的病毒株具有利用人源及絨猴源SLAM(Signaling lymphocytic activation molecμLe,信號淋巴激活分子)受體侵入機體造成生物安全的隱患。因此建立能用于分離與增殖CDV的敏感細胞系，在CDV的確診、疫苗研制以及致病機制研究中具有重要意義。正因如此，對細胞進行改造，使其適應病毒增殖，一直以來是CDV分離鑒定工作中亟待解決的問題。

Tatsuo等(2001)證實CDV可利用犬信號淋巴細胞激活分子 SLAM(又稱CD150)作為感染宿主動物的細胞受體。在此基礎上，趙建軍等(2010)分別克隆了犬瘟熱易感動物—狐貍、貉和水貂的 SLAM基因，并證實該3種SLAM可分別作為CDV感染宿主動物的細胞受體。因此，2010年，高玉偉等通過構建通過質粒轉染的方式，證實了表達SLAM的Vero細胞，可在感染后36-48h就能出現CPE，但該細胞存在質粒易丟失以及傳代不穩定等不足。2012年，姜騫等采用了慢病毒四質粒包裝系統獲得一株表達犬源SLAM的穩定細胞系MDCK-CSL，該細胞系將SLAM基因整合到MDCK細胞的基因組上，從而克服了高學偉等所建立的的細胞系質粒容易丟失的問題，且將接毒后CPE的時間縮短到24h。但姜騫等所構建的病毒系統基于 HIV的骨架，且需要3-4個質粒共轉染，方法較為復雜，對實驗室要求也較高。而本發明提供的一種基于逆轉錄病毒載體的構建方式，只需要2種質粒，而且操作簡便，所構建的細胞系可以穩定遺傳，安全性好、而且具有CDV病毒病變快、增殖滴度高，適合CDV病毒的分離和培養的特點。這在CDV的確診、CDV疫苗的研制和生產中具有重要意義。

發明內容