[發(fā)明專利]犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系SLAM-MDCK及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710248897.3
• 申請(qǐng)日: 2017-04-17
• 公開（公告）號(hào): CN107164409B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 韓麗;李文珂;張安定
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N15/66;C12N15/12;C12N5/10;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 武漢開元知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平;馮超

1.一種犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系SLAM-MDCK，所述犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系SLAM-MDCK基因組中含有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRetroX-SLAM基因組中的5’LTR至3’LTR的核苷酸序列，所述5’LTR至3’LTR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；其特征在于：所述犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系SLAM-MDCK由以下步驟制備而成：

1)根據(jù)上述SLAM基因的核苷酸序列為模板設(shè)計(jì)引物對(duì)，且引物上加有BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位點(diǎn)；

SLAM-P1:

5’-AACGGATCCGCCACCATGGATTCCAGGGGCTTC-3’；

SLAM-P2:5’-AGAGGGGCGGAATTCTTAGCTCTCTGGGAACGCAC-3’；

2)根據(jù)上述SLAM基因的核苷酸序列為模板進(jìn)行PCR，得到PCR產(chǎn)物；

3)用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ將PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，純化回收；同時(shí)，用BamHI和EcoRI將逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pRetroX-Tet3G進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并回收pRetroX-Tet3G大片段；

4)將回收的pRetroX-Tet3G大片段和回收的PCR產(chǎn)物用T4連接酶4℃連接過夜，得到pRetroX-SLAM；

5)將構(gòu)建的質(zhì)粒pRetroX-SLAM和包膜質(zhì)粒pVSV-G混合后，轉(zhuǎn)染GP2-293細(xì)胞，培養(yǎng)得到包裝好的SLAM逆轉(zhuǎn)錄病毒；

6)將制備的SLAM逆轉(zhuǎn)錄病毒與無血清DMEM培養(yǎng)基混合均勻，感染生長狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞，然后用含有G418的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，純化得到目的細(xì)胞，即為犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系SLAM-MDCK。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系SLAM-MDCK，其特征在于：所述步驟2)中，PCR反應(yīng)體系為：

反應(yīng)程序：

98℃ 10min，98℃ 10s；56℃ 30s；72℃ 1min 30個(gè)循環(huán)，72℃ 10min。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系SLAM-MDCK，其特征在于：所述步驟5)的具體步驟如下：

將GP2-293細(xì)胞均勻的鋪于6孔細(xì)胞板中，當(dāng)GP2-293細(xì)胞密度達(dá)到70-80％時(shí)轉(zhuǎn)染：將培養(yǎng)基棄掉，加入1.5ml無血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，將2μg質(zhì)粒pRetroX-SLAM和2μg包膜質(zhì)粒pVSV-G混勻后，再與8μL Lipofectamine2000混勻，接入到GP2-293細(xì)胞中；培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞上清500g，離心10min，收集上清，即為包裝好的SLAM逆轉(zhuǎn)錄病毒。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系SLAM-MDCK，其特征在于：所述步驟6)的具體步驟如下：

1)將生長狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞，均勻的鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板12小時(shí)后，棄上清；將制備的逆轉(zhuǎn)錄病毒1mL與無血清DMEM培養(yǎng)基1mL輕輕混勻后，加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，感染24h后，棄上清；將細(xì)胞用300μL胰蛋白酶消化處理，用10％FBS的DMEM重懸MDCK細(xì)胞，將MDCK細(xì)胞均勻鋪于10mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h后，棄掉舊的培養(yǎng)基，更換10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)加終濃度為1000μg/mL G418進(jìn)行篩選，與此同時(shí)加入一組沒有用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的MDCK細(xì)胞作為對(duì)照；

2)7天后待感染組細(xì)胞長滿，同時(shí)對(duì)照組細(xì)胞已經(jīng)全部死亡，將感染組細(xì)胞一傳十，繼續(xù)用終濃度為1000μg/mL G418進(jìn)行篩選，挑選單集落細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，并再次使用G418篩選，連續(xù)篩3代，純化出目的細(xì)胞，即為犬瘟熱病毒敏感細(xì)胞系SLAM-MDCK。