[發(fā)明專利]一種乳桿菌VBNC態(tài)的誘導(dǎo)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710248689.3
• 申請(qǐng)日: 2017-04-17
• 公開（公告）號(hào): CN106834197B
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 包秋華;張和平;王俊國(guó);王亞利
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N1/00;C12R1/225;C12R1/245
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11305
• 代理人: 呂世靜

本發(fā)明涉及一種乳桿菌VBNC態(tài)的誘導(dǎo)及其檢測(cè)方法，該方法包括乳桿菌的活化、乳桿菌VBNC態(tài)的誘導(dǎo)、乳桿菌VBNC態(tài)的檢測(cè)、熒光顯微鏡檢測(cè)樣品前處理與熒光顯微鏡檢測(cè)等步驟。本發(fā)明使干酪乳桿菌Zhang通過滅菌生理鹽水4℃誘導(dǎo)成功獲得了的該菌的VBNC態(tài)，保加利亞乳桿菌ND02在液體MRS中4℃誘導(dǎo)下進(jìn)入VBNC態(tài)，且乳桿菌的VBNC態(tài)細(xì)胞表面出現(xiàn)褶皺，長(zhǎng)度縮短，依舊保持完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)。所述的乳桿菌VBNC態(tài)仍具有一定的活性，并在適當(dāng)條件下會(huì)恢復(fù)至可培養(yǎng)態(tài)，為提高乳桿菌在生產(chǎn)應(yīng)用過程中活性的研究奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，本發(fā)明采用熒光染料(SYTO?9和PI)與Leica DM4000B正置熒光顯微鏡的結(jié)合建立了一種采用載玻片而非濾膜的方便、快速檢測(cè)細(xì)胞活性的方法。

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一種乳桿菌的VBNC態(tài)誘導(dǎo)方法。

【背景技術(shù)】

目前，人們認(rèn)為細(xì)菌通常有“活的可培養(yǎng)態(tài)”、“活的不可培養(yǎng)態(tài)”和“死亡態(tài)”三種狀態(tài)，活性細(xì)菌應(yīng)該指的是前兩種。早在上世紀(jì)80年代初，徐懷恕等人(Survival andviability ofnonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in theestuarine and marine environment.)就首次提出活的不可培養(yǎng)態(tài)(Viable butnonculturable,VBNC)細(xì)菌的概念。這種活的不可培養(yǎng)態(tài)細(xì)菌在不良外界條件下會(huì)處于異常的生理狀態(tài)，在常規(guī)培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)繁殖，但細(xì)菌在這種狀態(tài)下依然保持低水平代謝活性和一定的基因表達(dá)。當(dāng)惡劣環(huán)境解除時(shí)，它又會(huì)回到可培養(yǎng)狀態(tài)，所以VBNC態(tài)細(xì)菌也是有一定活性的。截止到2016年3月，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了42個(gè)屬的68種細(xì)菌存在VBNC態(tài)，但其中大部分為為革蘭氏陰性致病菌，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的研究并不多見。檢測(cè)某細(xì)菌是否具有VBNC態(tài)與細(xì)菌種類、誘導(dǎo)條件和檢測(cè)方法等有關(guān)。

乳酸菌是一類革蘭氏陽(yáng)性、過氧化氫酶陰性、不產(chǎn)生芽孢、發(fā)酵糖類物質(zhì)產(chǎn)生以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的細(xì)菌總稱。乳酸菌種類繁多，分布也極其廣泛，目前已發(fā)現(xiàn)乳酸菌包括43個(gè)屬，373個(gè)種和亞種，而且每年都有新乳酸菌種屬被分離和發(fā)現(xiàn)(http://www.bacteria.cict.fr/)。乳酸菌根據(jù)形態(tài)可分為桿菌和球菌；根據(jù)生化特性主要分為乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬、片球菌屬、鏈球菌屬和雙歧桿菌屬等。乳桿菌是乳酸菌的一個(gè)屬。

在研究我國(guó)少數(shù)民族地區(qū)自然發(fā)酵乳制品中乳酸菌多樣性時(shí)，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過DGGE、焦磷酸測(cè)序等非培養(yǎng)技術(shù)方法檢測(cè)到在平板培養(yǎng)法難以分離得到的乳酸菌種屬，這證實(shí)了在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中確實(shí)存在著VBNC態(tài)的乳酸菌。有些乳酸菌是人和動(dòng)物的腸道益生菌，它具有改善機(jī)體代謝，促進(jìn)生長(zhǎng)和提高免疫力等優(yōu)點(diǎn)，并對(duì)維持腸道的生態(tài)平衡有重要作用。但乳酸菌在進(jìn)入胃腸道系統(tǒng)時(shí)要面臨胃酸和膽鹽等不利自身生存的環(huán)境，可能會(huì)導(dǎo)致其進(jìn)入VBNC態(tài)，這樣不但影響了其自身的生長(zhǎng)和代謝，還可能會(huì)直接影響其應(yīng)用過程中益生功能的發(fā)揮。此外，在乳酸菌發(fā)酵劑的制備、生產(chǎn)和應(yīng)用過程中不可避免的要耐受各種環(huán)境壓力，諸如極端的溫度、酸、高溫、低溫、冷、滲透壓、氧和饑餓等，導(dǎo)致其可能進(jìn)入VBNC態(tài)。

采用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法不能對(duì)VBNC態(tài)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨著熒光染料與顯微鏡結(jié)合法、RT-PCR法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)法等非培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)，使我們能有更好地去研究活性細(xì)胞，特別是VBNC態(tài)細(xì)胞。熒光顯微鏡觀察法是研究VBNC態(tài)細(xì)菌最常見的方法，由于這種方法操作簡(jiǎn)單方便、節(jié)省時(shí)間，所以被廣泛于細(xì)菌活性的檢測(cè)。細(xì)菌活性檢測(cè)常用的熒光染料包括吖啶橙、SYTO-9、PI(碘化丙啶)、萘啶酮酸、溴化乙啶等。SYTO-9是一種能穿透完整細(xì)胞膜的小分子核酸熒光染料，PI是一種能滲透到細(xì)胞膜破損細(xì)胞內(nèi)的大分子核酸染料。細(xì)胞染色后在熒光顯微鏡下觀察時(shí)，有完整質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的活性細(xì)胞呈綠色，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被損壞的死細(xì)胞呈紅色。