[發明專利]一種乳桿菌VBNC態的誘導方法

有效

• 申請號: 201710248689.3
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN106834197B
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 包秋華;張和平;王俊國;王亞利
• 申請（專利權）人: 內蒙古農業大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/00;C12R1/225;C12R1/245
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所(普通合伙) 11305
• 代理人: 呂世靜

1.一種乳桿菌VBNC態的誘導方法，其特征在于該方法的步驟如下：

A.乳桿菌的活化

將冷凍保存的乳桿菌接種于液體MRS培養基中，在溫度37℃下進行活化培養，傳代培養三代，得到活化乳桿菌，離心分離，收集的菌泥用滅菌生理鹽水洗滌2～3次，然后重懸于滅菌生理鹽水中，制成乳桿菌菌懸液；所述的乳桿菌是干酪乳桿菌Zhang；該乳桿菌的活化是在溫度37℃下活化培養18～24小時；

B.乳桿菌VBNC態的誘導

將步驟A得到的乳桿菌菌懸液接入到滅菌生理鹽水誘導液體中，使乳桿菌終濃度10⁶～10⁷CFU/mL，混勻，采用MRS瓊脂培養基傾注培養法對誘導液中乳桿菌進行準確計數，平板計數結果為誘導液中初始活菌數，然后在4℃的溫度下對誘導液中乳桿菌進行VBNC態誘導；

C.乳桿菌VBNC態的檢測

步驟B的乳桿菌VBNC態誘導液充分震蕩混勻，采用MRS瓊脂培養基傾注培養，檢測誘導過程中乳桿菌的可培養活菌數；

D.熒光顯微鏡檢測樣品處理

步驟B的乳桿菌VBNC態誘導液充分震蕩混勻，再以10倍梯度將誘導液稀釋至適宜濃度，離心收集菌泥，得到的菌泥用滅菌生理鹽水洗滌2～3次，以除去它夾帶的誘導液體，再采用熒光顯微鏡檢測活性細胞數；

E.熒光染料溶液配制

將熒光染料SYTO-9與熒光染料PI分別稀釋在二甲基亞砜中，得到貯存濃度為50μM的SYTO-9溶液與300μM的PI溶液，兩種熒光染料溶液在低溫下避光保存備用；

F.乳桿菌熒光樣品制備

步驟D得到的洗滌菌泥用滅菌生理鹽水制成20μL或50μL懸浮液，然后向該懸浮液中加入步驟E配制的熒光染料SYTO-9與PI溶液，立即將菌液與熒光染料混勻后甩至管底，在室溫與避光的條件下進行染色反應15min；

吸取2μL染色完畢的菌懸液，滴在載玻片中心，然后加入2μL抗熒光淬滅封片劑混勻，蓋上蓋玻片，滴一滴無自發熒光的香柏油，在暗室中使用Leica DM4000B正置熒光顯微鏡，在激發波長450～490nm與發射波長515nm下觀察并計數；

G.熒光顯微鏡計數

在熒光顯微鏡計數時，隨機選擇至少10個不同的視野，且每個視野內的熒光細胞數在30～300個之間，最后取平均值；在視野中觀察到的呈現綠色熒光細胞被記為活性細胞，呈現紅色熒光細胞則被記為死菌細胞；細胞的具體計數按照以下公式：

式中：

E為樣品中乳桿菌活性細胞數，個/mL；S₁為蓋玻片面積，mm；S₂為顯微鏡油鏡視野面積，mm；V為樣品稀釋倍數；X為10個視野內平均細胞數，個。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟A中，收集活化乳桿菌菌泥是在轉速10000r/min下離心分離5～10min。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟C中，MRS瓊脂培養基傾注平板在溫度37℃的條件下恒溫靜置培養。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟A和D中，在用滅菌生理鹽水洗滌菌泥時，以克計菌泥與以毫升計滅菌生理鹽水的比是1：3～5。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟F中，向乳桿菌懸浮液中加入0.6倍體積的熒光染料SYTO-9與0.4倍體積的熒光染料PI。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于在步驟F中，所述的抗熒光淬滅封片劑是選自碧云天公司的P0126抗熒光淬滅封片劑。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于干酪乳桿菌Zhang在滅菌生理鹽水中在溫度4℃的誘導條件下第80天進入VBNC態；所述乳桿菌的VBNC態細胞表面出現褶皺，長度縮短，并保持完整細胞結構。