[發(fā)明專利]雙酶法制備鈣螯合肽的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710246307.3
• 申請日: 2017-04-15
• 公開（公告）號(hào): CN107056885A
• 公開（公告）日: 2017-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 汪少蕓;陳旭;蔡茜茜;徐梁棕;方衛(wèi)東
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K5/065
• 分類號(hào): C07K5/065;C07K1/20;C07K1/16;C12P21/06
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊,陳彩芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鈣（Ca）螯合肽，更具體地涉及了一種利用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶分步酶解裂殖壺菌粕蛋白制備的鈣螯合肽，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著海洋源活性肽研究與產(chǎn)品開發(fā)的興起，裂殖壺菌除了高含量的油脂外，仍含有相當(dāng)豐富的蛋白質(zhì)，并且這些蛋白質(zhì)富含能提供配位鍵的谷氨酸和天冬氨酸，可以有效的作為鈣離子配體與鈣元素形成螯合物，既起到了補(bǔ)充微量元素的作用，又能充分利用高營養(yǎng)價(jià)值的裂殖壺菌蛋白。

當(dāng)今，鈣缺失是影響人類健康的全球性問題，缺鈣造成機(jī)體的各種疾病，使人處于亞健康狀態(tài)。隨著國民生活水平的逐漸提高，同時(shí)市面上的各式各樣的補(bǔ)鈣制劑也在不斷的沖擊著人們的眼球，使得國民補(bǔ)鈣意識(shí)也在不斷增加。雖然這些補(bǔ)鈣劑能在一定程度上緩解鈣缺失的壓力，但卻也沒有從根本上改善國民缺鈣的狀況，并且也具有一定的副作用。近年來，隨著鈣補(bǔ)充制劑的發(fā)展，以及經(jīng)水解得到小肽易與鈣離子形成可溶性配合物，維持鈣在小腸內(nèi)的溶解狀態(tài)，促進(jìn)小腸對鈣的吸收，使得鈣螯合肽的開發(fā)將成為一個(gè)全球研究性熱點(diǎn)。研究表明，多肽螯合鈣由于其獨(dú)特的螯合體制和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，易被吸收、安全無毒、價(jià)格低、可同時(shí)補(bǔ)充氨基酸和鈣，而成為補(bǔ)鈣首選。

因此，如何獲得具有鈣螯合活性的肽，就成為制備新型鈣元素補(bǔ)充劑迫切的研究方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供了一種利用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶分步酶解裂殖壺菌粕蛋白制備的鈣螯合肽，使鈣螯合活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種鈣螯合肽，所述肽的氨基酸序列為：fy。所述鈣為Ca。

一種鈣螯合肽的制備方法，以裂殖壺菌粕蛋白為原料，采用堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對其進(jìn)行分步酶解，分離純化、冷凍干燥得到鈣螯合肽。

第一步酶解條件為：最適酶為堿性蛋白酶，時(shí)間為8 h，pH為9，酶底比為10wt.%，底物濃度為1 wt.%。第二步酶解條件為：最適酶為復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，酶底比為10 wt.%，溫度為40 ℃，pH為6，時(shí)間為3 h 50 min。

所述分離純化的具體步驟為：酶解產(chǎn)物首先利用Sephadex G-25凝膠過濾色譜進(jìn)行分離，洗脫液為去離子水，流速為0.3 mL/min，洗脫峰在214 nm下進(jìn)行測定；收集具有最高鈣螯合活性的峰，利用RP-HPLC-C18反相高效液相色譜再進(jìn)行進(jìn)一步分離，反相HPLC的分離條件是用體積分?jǐn)?shù)為0-40%乙腈溶液作為洗脫液梯度洗脫，流速為2 mL/min，收集洗脫峰，冷凍干燥得到所述的鈣螯合肽。

本發(fā)明立足于多肽具備與鈣離子螯合的作用位點(diǎn)，能夠與其形成穩(wěn)定的化合物，且多肽-鈣螯合物具有獨(dú)特的螯合體制和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，易被吸收、可同時(shí)補(bǔ)充氨基酸和鈣的理論基礎(chǔ)，以來自于海洋源的裂殖壺菌粕蛋白為原材料，通過堿性蛋白酶和復(fù)合風(fēng)味蛋白酶分步酶解的切割條件控制，切割制備具有高鈣螯合活性的肽，而使鈣螯合活性得以高效地實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明為裂殖壺菌粕蛋白的應(yīng)用提供了一條嶄新的思路。

附圖說明

圖1純化裂殖壺菌粕蛋白源鈣螯合肽的 RP-HPLC-C18色譜圖；其中SPH-1B為該特異性鈣螯合肽的色譜峰。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

采用的儀器、檢測手段如下：

本技術(shù)所采用的裂殖壺菌粕，由福建省水產(chǎn)研究所提供，酶購自諾維信生物技術(shù)有限公司（中國·天津）。首先進(jìn)行裂殖壺菌粕蛋白的提取，使用中藥粉碎機(jī)處理裂殖壺菌粕，過60目篩，獲得實(shí)驗(yàn)用原料。采用堿提酸沉的方法提取裂殖壺菌粕中的蛋白質(zhì)。配制濃度為0.39mol/L的NaOH溶液，按料液比1:100（w/v）在90℃下提取30min。將所獲得的樣液在4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min，取上清棄沉淀。再用6mol/L HCl調(diào)節(jié)上清液中的pH值，調(diào)節(jié)pH值至3.0，對蛋白質(zhì)進(jìn)行酸沉。靜置30min后，在4℃下以10000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。最終取沉淀?xiàng)壣锨澹鋬龈稍铮缓笤龠M(jìn)一步對其酶解。