[發明專利]一種快速檢測鴿子性別的引物及其試劑盒和應用以及檢測方法

在審

• 申請號: 201710245451.5
• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN108728550A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 周波;王倩;王玨
• 申請（專利權）人: 無錫微色譜生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6879;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

一種快速檢測鴿子性別的引物及其試劑盒和應用以及檢測方法，它涉及禽類或鳥類檢測領域。本發明的檢測引物如SEQ ID No.1至No.4所示。含有上述引物的試劑盒。檢測方法包括：鴿子羽髓樣本總DNA的提取，LAMP反應和電泳檢測或熒光染料檢測，確定鴿子性別的方法。本發明可以利用羽髓快速抽提DNA和常規血液抽提DNA，作為模板用于LAMP實驗。本發明根據鴿子(CHD1W)基因序列設計了LAMP引物，并建立檢測鴿子性別的技術及其應用方法的試劑盒，具有快速、靈敏、高度特異性和易推廣實用的優點。在早期雛鴿中快速鑒定出雛鴿性別，使鴿子性別比例適當，利于鴿舍安寧，提高產蛋率，利于產業化飼養管理和繁殖育種。

技術領域

本發明涉及禽類或鳥類檢測領域，具體涉及鴿子羽髓DNA的提取、鴿子性別鑒定的LAMP引物組、檢測鴿子性別的試劑盒及檢測方法。

背景技術

鴿子是一種單態性鳥，其雌雄個體外貌形態幾乎沒有差別，極難從外形上區分開。鴿子的雌雄鑒別是肉鴿生產、繁殖工作中最為關鍵的一環，如果性別比例不當，不但鴿舍難以安寧，而且產蛋率也受影響，不利于產業化飼養管理與繁殖育種，尤其在幼鴿期去公留母的蛋鴿產業中更為突出。因此，雌雄鑒別在養鴿業具有重要作用。目前，傳統的方法如翻肛鑒別、腹腔鏡檢、糞便類固醇檢測及核型分析，它們存在準確性低、操作復雜、成本高、對鴿子傷害較大等缺點，雖然采用PCR技術對CHD基因內含子在Z和W染色體的差異進行擴增鑒定可以克服這些缺點，但是所需儀器和技術專業性強，檢測環境要求苛刻、檢測周期長，所以其推廣及應用的成本非常高。因此，急需一種成本低，檢測準確性高，易于推廣的技術。

現有的環介導的等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是根據目的基因的6個特異區域,設計4～6條特異性引物，內引物(FIP、BIP)、外引物(F3、B3)、環引物(LF、LB)，利用Bst DNA聚合酶在60～65℃等溫條件下特異地擴增目的基因。LAMP擴增反應可在2小時之內完成，其擴增產物是和靶標反向重復的莖環結構以及多環的菜花樣結構，反應過程中產生大量焦磷酸根離子，加入熒光染料鈣黃綠素后，焦磷酸根離子與Mn²⁺結合，鈣黃綠素與Mg²⁺結合形成綠色熒光，沒有反應的樣品則不能產生焦磷酸根離子，鈣黃綠素與Mn²⁺結合呈棕黃色。也可以通過反應后體系內是否存在白色沉淀物、電泳結果是否具有梯狀條帶、加入SYBRGreenl是否變成綠色等不同方法進行檢測，具有檢測靈敏度高，檢測方法簡單快速、儀器要求不高等特點。LAMP技術現已被廣泛應用于微生物檢測及胚胎性別鑒定等領域，如，食品安全檢測、流行性病毒檢測、臨床診斷、對病菌、寄生蟲等的檢測，但是利用該技術對鳥類特別是鴿子的性別進行鑒定還沒有報道，因此，如何運用環介導恒溫擴增技術檢測生產實踐中鴿子性別的技術具有重大意義。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種簡便、快速、準確鑒定鴿子性別的試劑盒和LAMP檢測方法。

本發明的一種快速檢測鴿子性別的引物，所述的引物為LAMP引物，其序列為：

上游外引物FIP序列

CCAGTCTTTTCCTGTATGTAAAATTAAGAAGCCTTGATCTTTACCA；

上游內引物BIP序列

CTGATGAATTAGAAAGATGAAGTGTCAAAACAACTGAGGGGGT；

下游外引物F3序列CAGGTGAGAATTTTTCTGGTA；

下游外引物B3序列AGCAACTTTAATTCTCAATTGC。

本發明的試劑盒為含有上述引物的試劑盒。

本發明的試劑盒用于檢測鴿子性別，以及鑒定含Z和W染色體的鳥類和禽類的雌雄性別。