[發(fā)明專利]一種快速檢測鴿子性別的引物及其試劑盒和應(yīng)用以及檢測方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710245451.5
• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN108728550A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周波;王倩;王玨
• 申請（專利權(quán)）人: 無錫微色譜生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6879;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 侯靜

1.一種快速檢測鴿子性別的引物，其特征在于所述的引物為LAMP引物，其序列為：

上游外引物FIP序列

CCAGTCTTTTCCTGTATGTAAAATTAAGAAGCCTTGATCTTTACCA；

上游內(nèi)引物BIP序列

CTGATGAATTAGAAAGATGAAGTGTCAAAACAACTGAGGGGGT；

下游外引物F3序列CAGGTGAGAATTTTTCTGGTA；

下游外引物B3序列AGCAACTTTAATTCTCAATTGC。

2.含有權(quán)利要求1所述引物的試劑盒。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包括鴿子羽髓DNA的快速提取液、LAMP反應(yīng)液和顯色劑、陽性對照模板DNA和去離子水。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的鴿子羽髓DNA的快速提取液由Tris-buffer、DTT和蛋白酶K構(gòu)成。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的顯色劑為鈣黃綠素?zé)晒馊玖稀?/p>

6.如權(quán)利要求2所述的試劑盒應(yīng)用，其特征在于它用于檢測鴿子性別，以及鑒定含Z和W染色體的鳥類和禽類的雌雄性別。

7.一種快速檢測鴿子性別的方法，其特征在于它是按照以下步驟進(jìn)行的：

一、提取鴿子羽髓樣品的總DNA，作為LAMP反應(yīng)模板；

二、使用如權(quán)利要求2所述試劑盒，構(gòu)建LAMP反應(yīng)體系；

三、步驟二所述的LAMP反應(yīng)體系的模板包括LAMP反應(yīng)模板、陽性對照DNA模板和去離子水作為陰性對照模板；

四、將步驟二的LAMP反應(yīng)體系，置于60～65℃水浴中，反應(yīng)60～120分鐘，得到反應(yīng)液；

五、對步驟四的反應(yīng)液在80～100℃處理10分鐘，滅活Bst DNA聚合酶；

六、向步驟五處理后的反應(yīng)液中加入顯色劑，進(jìn)行檢測結(jié)果判定：若為綠色，則待測樣品性別為雌性；若為桔黃色，則待測樣品性別為雄性。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種快速檢測鴿子性別的方法，其特征在于步驟一提取鴿子羽髓樣品的總DNA的操作如下：

將鴿子羽髓樣品加入到裝有100μL鴿子羽髓DNA的快速提取液的eppendorf管中，然后加熱至56℃保持30分鐘，期間震蕩2次；再升溫至100℃保持8分鐘，期間震蕩1次，提取總DNA，并作為LAMP反應(yīng)模板。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種快速檢測鴿子性別的方法，其特征在于步驟二的LAMP反應(yīng)體系為20μL，包括：

2×LAMP Mix反應(yīng)緩沖液10μL，引物混合物4μL，F(xiàn)IP、BIP引物終濃度0.8μM，F(xiàn)3、B3引物終濃度0.2μM，8U/μL Bst DNA聚合酶1.5μL，25mM MgCl₂ 3μL，模板2μL。

10.一種快速檢測鴿子性別的方法，其特征在于它是按照以下步驟進(jìn)行的：

一、提取鴿子羽髓樣品的總DNA，作為LAMP反應(yīng)模板；

二、使用如權(quán)利要求2所述試劑盒，構(gòu)建LAMP反應(yīng)體系；

三、步驟二所述的LAMP反應(yīng)體系的模板包括LAMP反應(yīng)模板、陽性對照DNA模板和去離子水作為陰性對照模板；

四、將步驟二的LAMP反應(yīng)體系，置于60～65℃水浴中，反應(yīng)60～120分鐘，得到反應(yīng)液；

五、對步驟四的反應(yīng)液在80～100℃處理10分鐘，滅活Bst DNA聚合酶；

六、對步驟五處理后的反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果判定：若電泳結(jié)果為梯狀條帶，則待測樣品性別為雌性；若電泳結(jié)果為無條帶，則待測樣品性別為雄性。