[發(fā)明專利]檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測方法及其應用

在審

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• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN107219364A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設計）人: 韓飛;張曼;楊書會
• 申請（專利權）人: 楊凌職業(yè)技術學院;興平市眾和現(xiàn)代生態(tài)農牧有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535;G01N33/543;G01N21/31
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及一種檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測方法及其應用。

背景技術

副雞嗜血桿菌(Haemophilus paragallinarum，Hpg)是雞傳染性鼻炎的病原，該病臨床癥狀為雞的急性上呼吸道感染，鼻腔和鼻竇發(fā)炎，眼結膜發(fā)炎，流淚，病雞產(chǎn)蛋量下降，生長緩慢。雞傳染性鼻炎頻發(fā)于世界的各個地區(qū)，呈地方流行性，雖然該病致死率相對較低，但副雞嗜血桿菌可在雞群長期存在，降低雞的生產(chǎn)性能，導致產(chǎn)蛋率降低，育成雞生長遲緩，并且降低了病雞抵御其它疾病的能力，在抵抗力較弱的情況下極易繼發(fā)其它傳染病而死亡，給養(yǎng)殖戶造成巨大的經(jīng)濟損失，嚴重阻礙了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

目前關于副雞嗜血桿菌分子病原學的研究資料還很少，相關報道集中于診治。對于雞傳染性鼻炎的診斷方法和疫苗免疫效果的評價方法如臨床診斷、血凝試驗等不適合大范圍的樣品檢測，對于雞傳染性鼻炎疫情監(jiān)測以及疫苗的有效評估均需要建立更為靈敏、快捷的檢測方法。血凝素(HA)是Hpg抗原中重要的成分，也是Hpg分型的基礎，具有較好的抗原反應性，可與Hpg的陽性血清發(fā)生反應，對于雞傳染性鼻炎的流行病學檢測以及免疫效果的監(jiān)測具有廣泛的應用前景。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明實施例提供了一種檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測方法及其應用，主要目的是提供一種簡便、快速及準確檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明主要提供了如下技術方案：

一方面，本發(fā)明實施例提供了一種檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，所述試劑盒包括：包被酶標板、洗滌液、血清稀釋液、底物顯色液、兔抗雞酶標二抗、終止液、A型Hpg標準陽性血清和A型Hpg標準陰性血清；其中，所述包被酶標板是以A型副雞嗜血桿菌重組血凝素蛋白作為包被抗原。

作為優(yōu)選，所述A型副雞嗜血桿菌重組血凝素蛋白的核苷酸序列表為SEQ.ID.No.1。

作為優(yōu)選,所述A型副雞嗜血桿菌重組血凝素蛋白的制備方法包括：

設計合成引物，以A型副雞嗜血桿菌Hpg-8菌株的基因組為模板，通過PCR擴增得到血凝素的擴增產(chǎn)物，所述擴增產(chǎn)物連接其表達載體并同時進行雙酶切以構建重組質粒；將挑選的陽性重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，獲得陽性質粒單克隆菌，所述陽性質粒單克隆菌在IPTG誘導下進行蛋白表達得到誘導產(chǎn)物，所述誘導產(chǎn)物依次經(jīng)純化和復性后得到重組血凝素蛋白；其中，所述合成引物為：

上游引物：5'-CGCGGATCCATGAAAAAAACTGCAATCG-3'，

下游引物：5'-CCGCTCGAGCTCGTTACCTTTAACTGAGAT-3'。

作為優(yōu)選,所述洗滌液為含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，pH為7.4。

作為優(yōu)選,所述血清稀釋液為含50g/L脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液；所述底物顯色液為含有過氧化氫的四甲基聯(lián)苯胺溶液。

作為優(yōu)選,所述終止液為2M硫酸溶液。

作為優(yōu)選,所述包被抗原的包被濃度為5.0μg/mL；所述包被酶標板經(jīng)50g/L脫脂奶粉PBST封閉，裝入密封袋中置于4℃保存。

作為優(yōu)選,所述兔抗雞酶標二抗的稀釋倍數(shù)為1:2500。

另一方面，本發(fā)明實施例提供了上述檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒的檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：

用血清稀釋液以體積比1：200的比例稀釋待檢血清得到稀釋血清；

向96孔酶標板每孔中加入100μ所述稀釋血清，向酶標板各添加兩孔A型Hpg標準陽性血清和A型Hpg標準陰性血清作為對照，于37℃孵育1h，棄去反應孔中液體，再向每孔加入300μL洗滌液并洗滌3次，每次5分鐘，棄洗滌液，最后一次拍干；

向96孔酶標板每孔中加入100μL以體積比1:2500稀釋后的兔抗雞酶標二抗，于37℃孵育1h，棄去反應孔中液體，向每孔中加入300μL洗滌液并洗滌3次，每次5分鐘，棄洗滌液，最后一次拍干；

向96孔酶標板每孔中加入100μL底物顯色液，室溫下避光作用10分鐘；

向96孔酶標板每孔加入100μL終止液以終止顯色反應；

用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光光度(OD)值；