[發明專利]檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒及其檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 201710245190.7
• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN107219364A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 韓飛;張曼;楊書會
• 申請（專利權）人: 楊凌職業技術學院;興平市眾和現代生態農牧有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/535;G01N33/543;G01N21/31
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：包被酶標板、洗滌液、血清稀釋液、底物顯色液、兔抗雞酶標二抗、終止液、A型Hpg標準陽性血清和A型Hpg標準陰性血清；其中，所述包被酶標板是以A型副雞嗜血桿菌重組血凝素蛋白作為包被抗原。

2.根據權利要求1所述的檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于，所述A型副雞嗜血桿菌重組血凝素蛋白的核苷酸序列表為SEQ.ID.No.1。

3.根據權利要求1所述的檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于,所述A型副雞嗜血桿菌重組血凝素蛋白的制備方法包括：

設計合成引物，以A型副雞嗜血桿菌Hpg-8菌株的基因組為模板，通過PCR擴增得到血凝素的擴增產物，所述擴增產物連接其表達載體并同時進行雙酶切以構建重組質粒；將挑選的陽性重組質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，獲得陽性質粒單克隆菌，所述陽性質粒單克隆菌在IPTG誘導下進行蛋白表達得到誘導產物，所述誘導產物依次經純化和復性后得到重組血凝素蛋白；其中，所述合成引物為：

上游引物：5'-CGCGGATCCATGAAAAAAACTGCAATCG-3'，

下游引物：5'-CCGCTCGAGCTCGTTACCTTTAACTGAGAT-3'。

4.根據權利要求1所述的檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于,所述洗滌液為含0.05％吐溫-20的磷酸鹽緩沖液，pH為7.4。

5.根據權利要求1所述的檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于,所述血清稀釋液為含50g/L脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液；所述底物顯色液為含有過氧化氫的四甲基聯苯胺溶液。

6.根據權利要求1所述的檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于,所述終止液為2M硫酸溶液。

7.根據權利要求1所述的檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于,所述包被抗原的包被濃度為5.0μg/mL；所述包被酶標板經50g/L脫脂奶粉PBST封閉，裝入密封袋中置于4℃保存。

8.根據權利要求1所述的檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒，其特征在于,所述兔抗雞酶標二抗的稀釋倍數為1:2500。

9.權利要求1-8任一項所述的檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括以下步驟：

用血清稀釋液以體積比1：200的比例稀釋待檢血清得到稀釋血清；

向96孔酶標板每孔中加入100μ所述稀釋血清，向酶標板各添加兩孔A型Hpg標準陽性血清和A型Hpg標準陰性血清作為對照，于37℃孵育1h，棄去反應孔中液體，再向每孔加入300μL洗滌液并洗滌3次，每次5分鐘，棄洗滌液，最后一次拍干；

向96孔酶標板每孔中加入100μL以體積比1:2500稀釋后的兔抗雞酶標二抗，于37℃孵育1h，棄去反應孔中液體，向每孔中加入300μL洗滌液并洗滌3次，每次5分鐘，棄洗滌液，最后一次拍干；

向96孔酶標板每孔中加入100μL底物顯色液，室溫下避光作用10分鐘；

向96孔酶標板每孔加入100μL終止液以終止顯色反應；

用酶標儀在450nm波長下測定各孔吸光光度(OD)值；

根據OD值判定，當OD₄₅₀值≥0.34時，判定A型Hpg抗體水平為陽性，當OD₄₅₀值＜0.34時，判定A型Hpg抗體水平為陰性。

10.權利要求1-8任一項所述的檢測A型副雞嗜血桿菌抗體的間接ELISA試劑盒在檢測A型副雞嗜血桿菌抗體中的應用。