[發明專利]一種表達羥基化酶的重組菌及其在耦聯合成羥脯氨酸中的應用

有效

• 申請號: 201710243427.8
• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN107118999B
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發明（設計）人: 聶堯;徐巖;李斌;景曉冉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P41/00;C12P13/04;C12P13/24;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種表達羥基化酶的重組菌及其在耦聯合成羥脯氨酸中的應用，屬于生物催化技術領域。本發明構建了一株表達羥基化酶的重組菌，并進一步建立轉化羥基氨基酸的高效共性的反應體系。本發明在發酵與轉化耦聯的反應體系中，利用重組大腸桿菌催化底物L?脯氨酸，獲得產物反式?4?羥基?L?脯氨酸。通過優化重組酶的活性表達和調控轉化過程來強化產物合成，將菌體細胞接入發酵體系37℃培養3h后，變溫為20℃誘導培養60h，將溫度轉為30℃反應20h，得到產物反式?4?羥基?L?脯氨酸，產率達到95.8％。與粗酶和全細胞轉化體系相比，處理相對簡單，節約了時間和勞動成本，因此該重組大腸桿菌的發酵轉化耦聯系統是一種高效的生物催化系統。

技術領域

本發明涉及一種表達羥基化酶的重組菌及其在耦聯合成羥脯氨酸中的應用，屬于生物催化技術領域。

背景技術

反式-4-羥基-L-脯氨酸的化學結構為：

反式-4-羥基-L-脯氨酸是一種稀有亞氨基酸，在醫藥保健方面可以作為重要的醫藥中間體來合成消炎藥、碳青霉烯類抗生素等；在材料化工方面作為一種手性合成元件，用來合成聚酯碳酸、N-烷基吡咯、N-芳香基吡咯、(1S,4S)-2-氧雜-5-氮雜雙環庚烷以及生物堿TAN1251A]等具有高附加值的產品；在食品營養和護膚美容方面也具有廣泛的應用價值。

目前，國內生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法主要是生物組織提取法，然而從明膠或骨膠中利用酸水解的方法提取羥脯氨酸有諸多弊端，在當今提倡節能環保、綠色生產的政策下，微生物合成法的優點卻越來越明顯。

Lawrenced等從Streptomyces griseoviridusP8648中純化出脯氨酸-4-羥化酶，并對該酶的特性進行了初步研究，但此酶的表達量較低，每毫克蛋白每分鐘的羥脯氨酸產量僅為907pmol/L。劉合棟等將優化后的脯氨酸-4-羥化酶基因插入含有色氨酸串聯啟動子的pUC19質粒，構建重組質粒pUC19-ptrp2-Hyp，并導入大腸桿菌BL21(DE3)中。在搖瓶水平，重組菌以L-脯氨酸(200mM)為底物發酵8h，可積累(0.492±0.034)g/L的反式-4-羥脯氨酸，產物轉化率僅達到1.9％左右，產物轉化率過低。微生物合成法生產反式-4-羥基-L-脯氨酸的過程中，現有基因工程菌多以大腸桿菌為出發菌株，在搖瓶水平以脯氨酸為底物發酵生產羥脯氨酸的過程中，菌體生長緩慢，很難達到高密度發酵，脯氨酸的有效轉化率較低，從而造成生產原料的浪費。

雖然已有許多開展生物催化轉化羥基脯氨酸研究的相關報道，但能夠羥基化L-脯氨酸的資源仍然有限，且在以游離L-脯氨酸為底物時，底物脯氨酸的消耗率較低，羥脯氨酸的產率較低，有必要進一步開發新的羥基化酶，探索更經濟的生物轉化條件。

發明內容

本發明的目的是構建一種表達羥基化酶的重組菌，以及該重組菌在耦聯合成羥脯氨酸中的應用。本發明目的不僅僅在于構建一種表達羥基化酶的重組菌，并實現其在合成羥脯氨酸中的應用，從表達和轉化過程耦聯強化產物合成，進一步建立轉化羥基氨基酸的高效共性的反應體系。

本發明第一個目的是提供一種表達羥基化酶的重組菌，所述重組菌表達了編碼氨基酸序列為SEQ ID NO：2的基因。

在本發明的一種實施方式中，所述羥基化酶編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：1。

在本發明的一種實施方式中，所述重組菌的宿主細胞為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。

在本發明的一種實施方式中，所述重組菌的基因載體為pET28a。

本發明第二個目的是提供一種表達羥基化酶的重組菌的構建方法，包括如下步驟：

1)將核苷酸序列為SEQ ID NO：1的基因K1連接到載體pET28a，得到重組質粒pET28a-K1；