[發明專利]一種表達羥基化酶的重組菌及其在耦聯合成羥脯氨酸中的應用

有效

• 申請號: 201710243427.8
• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN107118999B
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發明（設計）人: 聶堯;徐巖;李斌;景曉冉
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P41/00;C12P13/04;C12P13/24;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種表達羥基化酶的重組菌，其特征在于，所述重組菌表達了編碼氨基酸序列為SEQID NO：2的基因。

2.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌的宿主細胞為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。

3.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：1。

4.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌的基因載體為pET28a。

5.權利要求1所述重組菌的構建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

1)將核苷酸序列為SEQ ID NO：1的基因K1連接到載體pET28a，得到重組質粒pET28a-K1；

2)將重組質粒pET28a-K1轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)感受態細胞，得到重組菌株。

6.一種利用權利要求1所述的重組菌耦聯合成反式-4-羥基-L-脯氨酸的方法，其特征在于，在含有L-脯氨酸作為底物的培養基中，對所述重組菌細胞發酵轉化耦聯合成反式-4-羥基-L-脯氨酸進行三階段溫度調控，從發酵產酶和生物轉化兩個過程強化產物合成；所述重組菌耦聯合成反式-4-羥基-L-脯氨酸的三階段溫度調控過程為：于37℃，220rpm振蕩培養3h；將培養條件變為20℃，自誘導表達培養過程20-60h；將溫度轉為30℃，轉化反應過程20-60h。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述培養基為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，甘油5g/L，葡萄糖0.5g/L，Alpha-乳糖10g/L，Na₂HPO₄ 7.1g/L，KH₂PO₄ 6.8g/L，NH₄Cl2.68g/L，Na₂SO₄ 0.71g/L，MgSO₄·7H₂O 3mM，CaCl₂ 0.015g/L，FeSO₄·7H₂O 3mM，L-脯氨酸20mM-100mM。

8.權利要求1所述的重組菌在反式-4-羥基-L-脯氨酸生產中的應用。

9.一種反式-4-羥基-L-脯氨酸生產方法，其特征在于，所述方法是利用氨基酸序列為SEQ ID NO:2的基因所表達的酶作為催化劑。