[發明專利]一種檢測鑒定非典型豬瘟病毒（APPV）的PCR引物及檢測方法與檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201710243135.4
• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN106929606A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 孫媛;馬靜云;藍天;麥凱杰
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 林麗明

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地，公開了一種檢測鑒定非典型豬瘟病毒（APPV）的PCR引物及檢測方法與檢測試劑盒。

背景技術

仔豬先天性震顫（Congenital tremors of piglet，CT），一般亦被稱作“仔豬抖抖病”，是指剛出生仔豬由于脊髓水平以上的中樞神經系統髓鞘形成了阻滯，出現的豬站立時全身性或局部性陣發痙攣的一種疾病。1854年德國首次報道此病,以后世界各地陸續報道了此病。目前為止，該病無有效的治療措施，大部分發病仔豬以死亡轉歸或淘汰處理。

2016年，Paulo Arruda等通過新一代基因測序技術確定致病病原，發現該致病病原與豬的瘟病毒（Porcine Pestivirus）更為接近，并用仔豬先天性顫抖病料接種懷孕中后期胎兒，成功復制出先天性震顫病例；該病原存在于血清、全血、小腦、大腦、腦干、脊髓、腸系膜淋巴結和支氣管淋巴結中。此外，Paulo Arruda等對美國5個不同的農場中患有先天性震顫仔豬組織提取出的病毒進行基因測序，推定該病毒為“非典型豬瘟病毒”（APPV）。而目前，我國關于APPV病毒研究進展的報道仍然很少，還尚未有檢測鑒定非典型豬瘟病毒的方法或試劑盒。

發明內容

本發明要解決的技術問題是克服現有非典型豬瘟病毒檢測鑒定方面存在的缺陷和不足，通過參考比對非典型豬瘟病毒的基因組序列，選擇保守的核甘酸序列作為擴增區域，設計了一對檢測非典型豬瘟病毒的PCR引物，所述引物能快速、方便、高效地檢測鑒定非典型豬瘟病毒，特異性好，靈敏度高。

本發明的目的是提供一種檢測鑒定非典型豬瘟病毒的PCR引物。

本發明另一目的是提供利用上述PCR引物來檢測鑒定非典型豬瘟病毒的方法。

本發明的再一目的是提供一種檢測鑒定非典型豬瘟病毒的試劑盒。

本發明的上述目的是通過以下技術方案給予實現的：

一對檢測鑒定非典型豬瘟病毒的PCR引物，所述PCR上下游引物APPV-F/R的序列依次如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示：

上游引物APPV-F：5’-CTGCCTTATGGGCGGTAGAAT-3’（SEQ ID NO.1）；

下游引物APPV-R：5’-ATCAGCACCATGTTCTTGGGAT-3’（SEQ ID NO.2）。

本發明根據參考與比對GenBank中非典型豬瘟病毒基因序列，選擇保守的核甘酸序列作為擴增區域，根據非典型豬瘟病毒cap蛋白設計出了一對檢測非典型豬瘟病毒基因的PCR引物，通過對該PCR引物的特異性、敏感性和重復性進行試驗，證實此引物能用于快速、方便、高效地檢測非典型豬瘟病毒，且特異性好，靈敏度高。

所述引物PCR引物可用于檢測和/或鑒定豬病樣組織中是否含有非典型豬瘟病毒；或用于檢測和/或鑒定非典型豬瘟病毒。

一種利用上述PCR引物檢測鑒定非典型豬瘟病毒的方法，包括如下步驟：

S1.提取待測樣品RNA，反轉成cDNA；

S2.將步驟S1所述cDNA為模板，以權利要求1所述引物進行PCR反應；

S3.將擴增產物電泳檢測，根據電泳結果判斷待測樣品中是否含有非典型豬瘟病毒；

優選地，所述PCR的反應體系為：2×Taq Master Mix 10μL，10μmol/L APPV-F 1μL，10μmol/L APPV-R 1μL，cDNA模板2μL，ddH₂O 6μL，共20μL。

更優選地，所述2×Taq Master Mix 所含成分濃度為：Taq DNA Polymerase (recombinant) 0.05 units/μL，MgCl₂ 4mM，dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP) 0.4mM。

優選地，所述PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性30s，49℃退火30s，72℃延伸90s，共33個循環；72℃終延伸10 min。

優選地，所述電泳檢測為取8μL PCR擴增產物，加入含溴化乙錠的1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，條件為130V，25min。

優選地，所述結果判斷的標準為：當PCR產物在1491 bp處有明顯發亮條帶，且陰性對照無同大小條帶，則顯示為對非典型豬瘟病毒呈陽性反應，即待測樣品中含有非典型豬瘟病毒。