[發(fā)明專利]一種用于哺乳動物細胞蛋白質(zhì)遞送工程菌株的構(gòu)建方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710242405.X
• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN107099495A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白芳;金守光;靳永新;劉穎;李振鵬;吳衛(wèi)輝;程志輝
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/85;C12R1/385
• 代理公司: 天津佳盟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司12002
• 代理人: 侯力

1.一種用于哺乳動物細胞蛋白質(zhì)遞送的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是：將銅綠假單胞菌PAK基因組中4個毒力因子exoS,exoT,exoY,ndk基因刪除，使銅綠假單胞菌對哺乳動物細胞無細胞毒性，獲得基因敲除株Δ4；將Δ4菌株中抑制III型蛋白分泌系統(tǒng)(T3SS)的popN基因從染色體上刪除，使細菌T3SS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)注入量顯著提高，最終獲得工程菌株Δ5。

2.權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的銅綠假單胞菌基因工程菌株Δ5的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用是指菌株Δ5能夠用于對多種哺乳動物細胞系實施蛋白質(zhì)遞送；即通過將目標蛋白與T3SS分泌信號肽ExoS₅₄融合表達于表達載體pExoS₅₄中，當(dāng)攜帶有該表達載體的Δ5菌株與哺乳動物細胞共同培養(yǎng)的時候，Δ5的T3SS被激活，目標蛋白與ExoS₅₄融合表達，隨后在ExoS₅₄信號肽的引導(dǎo)下，將目標蛋白注入到哺乳動物細胞當(dāng)中。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的銅綠假單胞菌基因工程菌株Δ5的應(yīng)用，其特征在于：所注入的目標蛋白為轉(zhuǎn)錄因子，酶，疫苗，結(jié)構(gòu)蛋白，或毒力因子。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的銅綠假單胞菌基因工程菌株Δ5的應(yīng)用，其特征在于：所述的細菌感染細胞的最佳條件是：隨著感染系數(shù)(MOI)和侵染時間的增加，蛋白質(zhì)的注入量也相應(yīng)增加；當(dāng)MOI為50，侵染4h，為最佳注入條件。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的銅綠假單胞菌基因工程菌株Δ5的應(yīng)用，其特征在于：所述的工程菌株Δ5能夠應(yīng)用于各種哺乳動物細胞系，包括人和鼠的皮膚細胞、肌細胞、腸道細胞、肝細胞、免疫細胞、胚胎干細胞和誘導(dǎo)性多能干細胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的銅綠假單胞菌基因工程菌株Δ5的應(yīng)用，其特征在于：所述的工程菌株Δ5能夠應(yīng)用于多領(lǐng)域研究，包括干細胞定向分化，細胞重編程，細胞基因編輯，蛋白質(zhì)功能研究。