[發明專利]一種用于哺乳動物細胞蛋白質遞送工程菌株的構建方法及應用

在審

• 申請號: 201710242405.X
• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN107099495A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 白芳;金守光;靳永新;劉穎;李振鵬;吳衛輝;程志輝
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/85;C12R1/385
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司12002
• 代理人: 侯力

【技術領域】

本發明屬于生物技術領域，涉及的是一種用于哺乳動物細胞蛋白質遞送的銅綠假單胞菌基因工程菌株的構建方法及其應用。

【背景技術】

目前應用最普遍的細胞內蛋白質導入技術是基于DNA/RNA的轉染法，其2大缺陷是：①外源核酸片段有可能隨機整合到基因組中而誘發癌變或其他不可預見的后果。②外源蛋白質的表達一旦啟動無法有效地終止。如果能將興趣分子直接以“蛋白質”的形式輸送到靶細胞內，則可以克服以上缺點。首先，蛋白質導入避免了外源DNA/RNA帶來的基因組不穩定性。其次，由于外源蛋白質進入細胞內會被胞內自身的蛋白酶降解，使其作用時間可控。目前蛋白質導入方法已見多項報道，如顯微注射，轉染試劑(TransfectionReagent)和蛋白轉移結構域(ProteinTranslocationDomain)介導的蛋白導入法，但這些種方法的蛋白質遞送效率都很低，而且轉染試劑對靶細胞有很大毒性，后者則僅限于小分子量蛋白質的導入。此外，上述方法均涉及對目標蛋白的分離純化，其操作繁瑣且成本高，不適用于大規模生產。

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)屬于假單胞菌科、假單胞菌屬，革蘭式陰性細菌。其分布廣泛，在自然界(土壤、水和空氣)、植物表面、人體的皮膚、腸道和呼吸道中均有分布。銅綠假單胞菌的III型蛋白分泌系統(TypeIIIsecretionsystem，T3SS)是其表面形成的一種針狀復合物結構，可穿透真核細胞的細胞膜從而將細菌的毒素蛋白直接注入到靶細胞內，且不涉及細菌進入到靶細胞內，是自然界存在的一種高效的蛋白質注入機制。銅綠假單胞菌PAK菌株具有3種主要的毒素蛋白：ExoS，ExoT和ExoY，銅綠假單胞菌利用其T3SS將這些毒素蛋白注入靶細胞內有助于該菌在宿主環境中的存活。近年來發現ndk基因編碼產物核苷二磷酸激酶(NDK)，是另一種通過T3SS注入到細胞中的毒力因子，NDK的注入可以被前3種主要的效應因子所抑制，在ExoS、ExoT和ExoY缺失的菌株中，NDK的注入量顯著提高，并產生明顯的細胞毒性。popN基因編碼產物可以抑制細菌T3SS蛋白質注入，popN基因突變子在非誘導條件下便能夠分泌效應蛋白,顯示popN基因編碼的蛋白對T3SS具有負調控作用。

【發明內容】

本發明的目的是構建一種無細胞毒性、且具有高T3SS活性的銅綠假單胞菌基因工程菌株，通過該菌的T3SS將外源蛋白質注入到哺乳動物細胞中，發明一種可應用于哺乳動物細胞蛋白質遞送的工程菌株的構建方法及應用。

本發明的技術方案

一種用于哺乳動物細胞蛋白質遞送的基因工程菌株的構建方法，將銅綠假單胞菌PAK基因組中4個毒力因子基因exoS,exoT,exoY,ndk刪除，使銅綠假單胞菌對哺乳動物細胞無細胞毒性，獲得菌株Δ4；將菌株Δ4中抑制III型蛋白分泌系統(T3SS)的popN基因從染色體上刪除，使菌株Δ4的T3SS介導的蛋白質注入量顯著提高，最終獲得工程菌株Δ5。

本發明同時提供了所述方法制備的銅綠假單胞菌基因工程菌株Δ5的應用：所述應用是指菌株Δ5能夠用于對多種哺乳動物細胞系實施蛋白質遞送；即通過將目標蛋白與菌株Δ5的T3SS分泌信號肽ExoS₅₄融合表達于表達載體pExoS₅₄中，當攜帶有該表達載體的Δ5菌株與哺乳動物細胞共同培養的時候，Δ5的T3SS被激活，目標蛋白與T3SS信號融合蛋白大量表達，在T3SS分泌信號肽ExoS₅₄的引導下將目標蛋白高效地注入到哺乳動物細胞當中。

所注入的目標蛋白可以為轉錄因子，酶(如核酸酶TALEN，Cas9，Cre重組酶)，疫苗，結構蛋白，或毒力因子等。

所述的細菌感染細胞的最佳條件是：隨著感染系數(MOI)和侵染時間的增加，蛋白質的注入量也相應增加；當MOI為50，侵染4h，為最合適的條件。

所述的工程菌株Δ5能夠應用于各種哺乳動物細胞系，包括人和鼠的皮膚細胞、肌細胞、腸道細胞、肝細胞、免疫細胞、胚胎干細胞和誘導性多能干細胞(iPS細胞)。

所述的工程菌株Δ5適用于多領域研究工作，包括干細胞定向分化，細胞重編程，細胞基因編輯，蛋白質功能研究。

本發明的有益效果

本發明利用基因改造的銅綠假單胞菌Ⅲ型分泌系統作為一種蛋白質遞送的工具，能夠簡單、高效地將外源蛋白質注入到哺乳動物細胞內，不涉及DNA/RNA隨機整合導致的基因組不穩定性，且適合大規模生產。

【附圖說明】