[發明專利]通過即時電暈制作滯育性轉基因家蠶的方法

在審

• 申請號: 201710239491.9
• 申請日: 2017-04-12
• 公開（公告）號: CN107027718A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 張雨麗;張桂征;趙愛春;龍定沛;閉立輝;向仲懷;韋偉;韋博尤;黃文功;魯成;蘇紅梅;黃玲莉
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區蠶業技術推廣總站;西南大學
• 主分類號: A01K67/04
• 分類號: A01K67/04
• 代理公司: 廣西南寧公平知識產權代理有限公司45104
• 代理人: 楊立華

1.一種通過即時電暈制作滯育性轉基因家蠶的方法，其特征在于利用高壓電場對轉基因注射后的滯育性家蠶卵進行即時電暈刺激使其解除滯育，直接進入孵化期。

2.根據權利要求1所述的通過即時電暈制作滯育性轉基因家蠶的方法，其特征在于：所述高壓電場來自電暈儀，電暈儀主要由電源和正、負極板組成，電源的輸出端分別通過連接線連接正、負極板，正、負極板通過絕緣桿相互平行間隔地安裝在底座上，負極板上放置有蠶卵金屬載片，正極板上設有垂直蠶卵金屬載片的極針。

3.根據權利要求2所述的通過即時電暈制作滯育性轉基因家蠶的方法，其特征在于：所述正、負極板規格為15cm×8cm，正、負極板間隔15mm，極針長10mm，針距8mm。

4.根據權利要求3所述的通過即時電暈制作滯育性轉基因家蠶的方法，其特征在于：所述高壓電場為8.0-12KV，所述即時電暈刺激時間為10s-4min。

5.根據權利要求1所述的通過即時電暈制作滯育性轉基因家蠶的方法，其特征在于：所述轉基因注射的基因為羊毛角蛋白3.2基因、羊毛角蛋白4.3基因、橙黃色熒光蛋白基因、羊毛角蛋白5.4基因。

6.根據權利要求1所述的通過即時電暈制作滯育性轉基因家蠶的方法，其特征在于：所述滯育性家蠶卵來自家蠶滯育性中系品種或日系品種。

7.根據權利要求6所述的通過即時電暈制作滯育性轉基因家蠶的方法，其特征在于：所述滯育性家蠶卵來自家蠶滯育性中系品種“932”、日系品種“7532”或日系品種“大造”。

8.根據權利要求2所述的通過即時電暈制作滯育性轉基因家蠶的方法，其特征在于包括以下步驟：

<1>按常規催青方法催青蠶種；

<2>按常規方法飼養；

<3>熟蠶轉移到25℃的環境中上簇、結繭，化蛹后采下繭，用刀銷開辨認雌雄，分開放置，待其化蛾后交配4h拆對，將雌蛾投放于上漿的蠶種紙上產卵，每間隔1h收集一次蠶卵，并將收集的蠶卵置于25℃的環境中保護；

<4>將蠶卵連同蠶種紙片用自來水沖洗以后，于蒸餾水中浸泡2-3min，而后用鑷子將蠶卵轉移至用75％酒精消毒的蠶卵金屬載片上，并按照蠶卵腹面向右的標準將其排列整齊，排列好的蠶卵置于35-37％的甲醛蒸氣中消毒5min；

<5>以收集蠶卵時間開始記時，于收集后3-6h用顯微注射儀將10-15nL、總濃度400ng/μL的轉座載體質粒從蠶卵腹面中央注入已經消毒的蠶卵中，并用無毒的膠水封閉卵殼上注射留下的小孔；

<6>注射完的蠶卵置于35-37％的甲醛蒸氣中消毒5min，放25℃的環境中保護；

<7>以收集蠶卵時間開始記時，將帶有注射過蠶卵的蠶卵金屬載片在20-40h之間放到電暈儀上，8.0-12KV刺激10s-4min；

<8>電擊處理后的蠶卵，置于溫度25-28℃，相對濕度80-90％的條件下，進行催青直到孵化，飼養孵化出來的蟻蠶，將當代G0的蠶蛾進行自交或回交，獲得滯育性的G1代蠶卵，G1代蠶卵經即時電暈處理后于轉青期在熒光顯微鏡下掃描篩選獲得轉基因個體；最后將獲得的轉基因個體正常飼養、繼代。