[發(fā)明專利]通過即時(shí)電暈制作滯育性轉(zhuǎn)基因家蠶的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710239491.9
• 申請(qǐng)日: 2017-04-12
• 公開（公告）號(hào): CN107027718A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張雨麗;張桂征;趙愛春;龍定沛;閉立輝;向仲懷;韋偉;韋博尤;黃文功;魯成;蘇紅梅;黃玲莉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站;西南大學(xué)
• 主分類號(hào): A01K67/04
• 分類號(hào): A01K67/04
• 代理公司: 廣西南寧公平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司45104
• 代理人: 楊立華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因家蠶技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種通過即時(shí)電暈制作滯育性轉(zhuǎn)基因家蠶的方法。

背景技術(shù)

家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲和鱗翅目昆蟲模式生物。家蠶有一個(gè)重要的生理現(xiàn)象是化性，即一年中發(fā)生的世代數(shù)。一化性蠶品種一年只經(jīng)歷一個(gè)世代，然后產(chǎn)下的卵進(jìn)入一個(gè)漫長的滯育期，直到第二年在合適的溫濕度條件下解除滯育開始發(fā)育；二化性家蠶品種一年內(nèi)在自然環(huán)境中發(fā)生兩代，浸泡鹽酸法可人工解除滯育控制繁殖代數(shù)；多化性家蠶品種，一年內(nèi)發(fā)生三代以上，非滯育性多化種沒有滯育期。二化性家蠶品種幼蟲生長期、蠶繭大小介于一化與多化蠶品種之間，其體質(zhì)、繭絲質(zhì)性狀等也很適合蠶業(yè)生產(chǎn)所需的平衡要求，所以蠶業(yè)生產(chǎn)普遍使用二化性滯育卵，形成了生產(chǎn)性狀優(yōu)良、品種豐富的二化性品種群體。

自2000年日本科學(xué)家首次成功培育轉(zhuǎn)基因家蠶以來，轉(zhuǎn)基因家蠶成功的報(bào)道逐漸增多。絕大多數(shù)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)都是利用多化性家蠶品種，但多化性家蠶品種經(jīng)濟(jì)性狀差，利用家蠶滯育性品種進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究可以克服多化性家蠶品種在轉(zhuǎn)基因研究中的諸多缺陷。家蠶滯育性品種的轉(zhuǎn)基因研究具有極為重要的意義。家蠶滯育品種在產(chǎn)卵以后便進(jìn)入滯育期，滯育卵一般在產(chǎn)卵后約16-20小時(shí)左右利用常規(guī)的即時(shí)浸酸法或者經(jīng)過長期的低溫冷藏方法解除滯育開始孵化。但是，目前最有效的家蠶轉(zhuǎn)基因顯微注射時(shí)間是在產(chǎn)卵后3-6小時(shí)，轉(zhuǎn)基因操作后卵上會(huì)留下注射小孔，如果在注射后利用常規(guī)的即時(shí)浸酸法會(huì)導(dǎo)致鹽酸滲入蠶卵內(nèi)，使其死亡，根本無法實(shí)現(xiàn)家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因研究；轉(zhuǎn)基因注射留下的小孔也使得蠶卵不能長期放置，所以不能采用長期低溫冷藏方法解除滯育。因此，家蠶滯育品種卵的滯育，給轉(zhuǎn)基因操作帶來很大的限制。

目前，利用滯育性家蠶品種進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的方法主要有以下幾種，它們各存缺陷：

(1)西南大學(xué)趙愛春等探索了在蠶卵受精后立即進(jìn)行浸酸的方法并成功的獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因方法(家蠶滯育品種的早期浸酸轉(zhuǎn)基因方法，專利號(hào)200710303904.1，公開日2008年06月11日)。然而，由于該法需要浸酸，顯微注射后孵化率較低，而且早期浸酸的效果在品種間的差異比較大。

(2)西南大學(xué)趙愛春等還利用特殊的催青條件改變家蠶滯育品種下一代蠶卵的化性，并結(jié)合常規(guī)的家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)，有效制作出轉(zhuǎn)基因蠶(家蠶滯育種的低溫催青轉(zhuǎn)基因方法，專利號(hào)200710303903.7，公開日2008年06月11日)。雖然該法在注射后孵化率與多化性蠶卵不相上下，但是低溫催青的效果在品種間的差異非常大，對(duì)一化性和日系二化性蠶品種基本上不適用。

(3)西南大學(xué)馬三垣等利用親代所處環(huán)境條件與子代蠶卵滯育性的關(guān)系，使親代家蠶在經(jīng)嚴(yán)格控制的特殊環(huán)境條件下進(jìn)行催青、飼養(yǎng)和種繭保護(hù)，并采用適當(dāng)?shù)慕慌浞绞揭垣@得非滯育的子代蠶卵，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因注射，獲得轉(zhuǎn)基因蠶(家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因方法，專利號(hào)200910103397.6，公開日2009年08月12日)。該法一定程度上解決了日系二化性蠶品種無法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因注射的難題，但日系品種仍然解除滯育率不高，且親代家蠶需在恒溫、恒濕、絕對(duì)黑暗等嚴(yán)苛的環(huán)境下催青、飼養(yǎng)和種繭保護(hù)，試驗(yàn)條件要求高、成本大；催青溫度只有15℃，需要一個(gè)多月的催青時(shí)間；養(yǎng)蠶溫度也不高，蠶生長發(fā)育所需時(shí)間長，大大延長了轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)的周期；這種養(yǎng)蠶、制種方式與生產(chǎn)實(shí)際相差大，對(duì)后代的強(qiáng)健性有很大影響，幼蟲成活率低。

(4)蘇州大學(xué)徐世清等利用親代蠶卵催青孵化時(shí)期的保護(hù)溫度與光制組合，以及對(duì)子代受精前蠶卵的人工孵化處理，獲得早期活化卵，然后進(jìn)行常規(guī)顯微注射并進(jìn)行篩選，獲得轉(zhuǎn)基因蠶卵的方法(一種家蠶二化性品種卵轉(zhuǎn)基因用蠶卵的制備方法，專利號(hào)200910212990.4，公開日2010年05月12日)。該方法將低溫催青(20℃)、全齡光照飼養(yǎng)與早期浸酸相結(jié)合，一定程度上提高了孵化率，但仍然存在上述操作復(fù)雜、試驗(yàn)周期長等問題。

(5)西南大學(xué)龔競等將轉(zhuǎn)基因處理后的滯育性蠶卵置于密閉環(huán)境中進(jìn)行充氧處理，以解除滯育(一種阻斷轉(zhuǎn)基因家蠶卵滯育的方法，專利申請(qǐng)?zhí)?01610569284.5，公開日2016年12月07日)。該法在密閉的設(shè)備中進(jìn)行長時(shí)間的充氧(10-50h)，實(shí)驗(yàn)要求高；而且前人的研究論文中也發(fā)現(xiàn)氧氣或臭氧解除家蠶卵滯育性的效果不穩(wěn)定。

因此，探索一種省時(shí)、省力、技術(shù)要求低，又能適用于所有滯育性家蠶品種的轉(zhuǎn)基因方法，仍然是實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因家蠶成果快速應(yīng)用到蠶桑產(chǎn)業(yè)的迫切需求。