[發(fā)明專利]IL7R基因缺失斑馬魚突變體的制備及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710235846.7
• 申請日: 2017-04-12
• 公開（公告）號: CN107058320B
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李玉皓;蔡世嬌;陳陽
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/85;A01K67/027;C12Q1/6888
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11279
• 代理人: 朱萍;李紅偉

1.一種sgRNA片段，其特征在于，所述sgRNA的DNA序列為5-’ACTCCACTCACTCCAGTCACCGG-3’。

2.一種基因打靶試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的sgRNA。

3.一種基因敲除方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1所述的sgRNA片段識別目的基因上的雙鏈上的不同靶位點，與一種核酸酶結(jié)合并通過識別靶位點處PAM序列，引導核酸酶結(jié)合到目的基因靶位點處，并開始進行隨機剪切，隨后從切口處脫落，形成DSB缺口，隨后細胞通過非同源末端連接修復機制修復目的基因雙鏈，造成移碼突變，最終目的基因被敲除。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基因敲除方法，其特征在于，所述sgRNA片段與核酸酶發(fā)揮作用的數(shù)量為一個或以上。

5.一種IL7R基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：

(1)將權(quán)利要求1所述的sgRNA和Cas9 mRNA共同導入斑馬魚中；

(2)培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的IL7R基因缺失斑馬魚突變體。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述sgRNA的獲得步驟如下：

(1)確定IL7R基因敲除的靶位點；

(2)根據(jù)步驟(1)確定的靶位點序列設(shè)計擴增引物，PCR獲得sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄的模板；

(3)根據(jù)步驟(2)獲得的模板進行體外轉(zhuǎn)錄。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述sgRNA的獲得步驟如下：

(1)查詢斑馬魚IL7R基因的基因組DNA序列及其功能結(jié)構(gòu)域，根據(jù)CRISPR/Cas9敲除原理，設(shè)計一對IL7R基因的靶位點；

(2)PCR法獲得sgRNA的體外轉(zhuǎn)錄的模板，正向引物序列為：5’TAATACGACTCACTATAGACTCCACTCACTCCAGTCACgttttagagctagaaatagc-3’，前18位堿基序列是T7啟動子，19-38位堿基序列是sgRNA靶序列，小寫字母表示的堿基序列為sgRNA上游骨架；反向引物序列為25bpsgRNA下游骨架，序列為5’-AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCAC-3’，按照下列PCR條件進行擴增：預變性95℃3min；變性95℃30s，退火54℃30s，延伸72℃20s進行35個循環(huán)，再72℃10min；PCR產(chǎn)物回收純化；

(3)以RNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述Cas9 mRNA是按照以下步驟獲得的：

以T7驅(qū)動的人源化的Cas9編碼序列為模板，用T7 RNA聚合酶進行Cas9體外轉(zhuǎn)錄，然后戴帽并加polyA尾；RNA經(jīng)無水乙醇法沉淀，用DEPC處理過的超純水重懸。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，sgRNA和Cas9 mRNA共同導入斑馬魚中，包括：將sgRNA和Cas9 mRNA混合，sgRNA終濃度為50ng/μL、Cas9 mRNA終濃度為250ng/μL，在斑馬魚胚胎1-4細胞期進行顯微注射，注射量為1nL。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，培養(yǎng)獲得穩(wěn)定遺傳的IL7R基因缺失斑馬魚突變體，包括：

(1)對經(jīng)過注射的斑馬魚進行基因型鑒定，確定IL7R基因敲除的初建者F0；

(2)IL7R基因敲除的初建者F0個體進行自交獲得F1；

(3)利用基因型鑒定的方法確定IL7R基因敲除的F1；

(4)從F1代突變體中挑選相同突變的雌魚和雄魚，雜交得到F2代；

(5)鑒定為F2代中IL7R基因敲除的純合子即為穩(wěn)定遺傳的IL7R基因缺失斑馬魚突變體。