[發(fā)明專利]IL7R基因缺失斑馬魚突變體的制備及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710235846.7
• 申請日: 2017-04-12
• 公開（公告）號: CN107058320B
• 公開（公告）日: 2019-08-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李玉皓;蔡世嬌;陳陽
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/85;A01K67/027;C12Q1/6888
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11279
• 代理人: 朱萍;李紅偉

本發(fā)明公開了一種IL7R基因缺失斑馬魚突變體及其制備方法，IL7R基因缺失斑馬魚突變體的構(gòu)建是通過CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)的。另外，本發(fā)明還公開了IL7R基因缺失斑馬魚突變體的應(yīng)用，本發(fā)明的突變體模型可用于研究IL7R在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及髓鞘形成中的作用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基因敲除的斑馬魚突變體，具體涉及IL7R基因缺失斑馬魚突變體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

白細胞介素7受體(interleukin 7receptor,IL7R)屬于Ⅰ型細胞因子受體家族成員的跨膜受體，由α鏈(IL7Rα，CD127)和γ鏈(γc，CD132)組成，α鏈?zhǔn)荌L7R的特異性組分；γ鏈?zhǔn)荌L2、IL4、IL7、IL9、IL15、IL21等細胞因子受體的共同組分，也被稱為共有γ鏈，是啟動IL7R下游信號表達的必需成分。生理情況下，IL7R是淋巴細胞增殖和分化的必需關(guān)鍵因子；病理情況下，IL7R功能缺陷可導(dǎo)致重癥聯(lián)合免疫缺陷病，而IL7R獲得性突變可引起急性T淋巴細胞白血病等。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated nuclease(Cas)，CRISPR/Cas)系統(tǒng)是細菌或古細菌在長期演化過程中形成的抵御外來遺傳物質(zhì)的一種獲得性免疫防御機制，能夠識別自身和外源入侵DNA片段。CRISPR/Cas系統(tǒng)有3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中II型CRISPR/Cas系統(tǒng)只需要一個Cas9核酸內(nèi)切酶切割DNA雙鏈，即CRISPR/Cas9系統(tǒng)。在向?qū)NA(single guide,sgRNA)指導(dǎo)下，Cas9內(nèi)切酶像剪刀一樣對特定基因、特定位點進行靶向性剪切，形成雙鏈DNA缺口，細胞可以通過同源重組修復(fù)或者非同源性末端連接對斷裂DNA進行修復(fù)，從而實現(xiàn)對基因的編輯。作為一種新興基因組編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有實驗簡單、操作容易和節(jié)省時間等優(yōu)勢。利用CRISPR/Cas9技術(shù)在酵母、擬南芥、小鼠、大鼠、果蠅、青蛙等不同物種都成功進行了基因定向改造。在斑馬魚研究領(lǐng)域，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也被廣泛應(yīng)用于精確和靶向性的基因編輯。在單細胞胚胎階段通過注射sgRNA和Cas9 mRNA能夠快速、高效獲得基因敲除斑馬魚突變體，并且可以遺傳給子代，這大大拓展了在斑馬魚中進行基因功能缺失的研究。

申請人先在幼魚脫髓鞘模型上以基因芯片進行了表達譜分析，在獲得的差異表達基因中，申請人發(fā)現(xiàn)，IL7R表達顯著降低，提示IL7R可能與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育有密切關(guān)系。斑馬魚的IL7R和人類IL7R的相似度為73％，利用IL7R基因敲除突變體進行研究是一個有效途徑，然而，目前國內(nèi)外尚無報道。申請人認為，有必要構(gòu)建IL7R基因敲除斑馬魚突變體，并以此為模型對IL7R在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及髓鞘形成中的作用進行在體實驗研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種sgRNA片段以及使用該sgRNA片段構(gòu)建IL7R基因缺失斑馬魚突變體的方法。為此，發(fā)明人進行了大量的實驗，在眾多sgRNA中篩選出活性最高的一種sgRNA并將其用于突變體的構(gòu)建中，從而獲得了穩(wěn)定遺傳的IL7R基因缺失斑馬魚突變體。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種sgRNA片段，所述sgRNA的DNA序列如5-’ACTCCACTCACTCCAGTCACCGG-3’所示，其中3’端的CGG為PAM識別位點。

本發(fā)明提供了一種基因打靶試劑盒，所述試劑盒包括前面所述的sgRNA。使用該試劑盒可以用于IL7R基因表達的沉默。