[發明專利]一種脂肪多能細胞的分離及其培養方法

在審

• 申請號: 201710235638.7
• 申請日: 2017-04-12
• 公開（公告）號: CN108690828A
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 張繼崗;王灝川
• 申請（專利權）人: 上海聚仁生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 31230
• 代理人: 劉立平

本發明提供一種脂肪多能細胞的培養方法，包括如下步驟：(1)在無菌條件下獲取脂肪細胞和/或組織；(2)將所述脂肪細胞和/或組織接種在培養基中培養，并在所述培養基中加入細胞生長調節劑，以使脂肪多能細胞生長，從而使所述脂肪細胞和/或組織進入增殖狀態；及(3)培養所述脂肪多能細胞，使其持續增殖為具有干細胞特性的細胞。本發明而且找到了能維持、支持、多能細胞的生命物質，用生命物質代替藥物；可以通過組織器官的復制，及時生理性修補組織器官，維持生命器官的平衡，治療疑難頑癥和疾病，使病人擺脫醫療痛苦和損傷；并有望用細胞作為載體的方法，攻克癌癥。

技術領域

本發明涉及一種脂肪多能細胞的分離及其培養方法，尤其是一種來源于人脂肪組織的多能細胞的分離及其培養方法。

背景技術

20世紀末以來，生命科學研究發現：干細胞可在體外培養成人體的各個器官特征的細胞/組織。因此，體外培養“建造器官”，有望在不久的將來進行“自體器官”移植治療疾病；或者，將干細胞注射在人體的某一部位，讓干細胞在局部發揮一個器官的功能，最終實現對疾病的治療。但是干細胞治療受限于干細胞的來源以及數量。因此干細胞需要進行培養，使其增殖。

現有技術中，細胞培養是指模擬體內環境，在無菌、適當溫度及酸堿度和一定營養條件下，使細胞生長繁殖，并維持其結構和功能的一種培養技術。細胞培養的對象為單個細胞或細胞群。

細胞培養的環境要求無毒和無菌，是保證細胞生存的首要條件。當細胞放置于體外培養時，與體內相比細胞缺失了對微生物和有毒物的防御能力，一旦被污染或自身代謝物質積累等，可導致細胞死亡。因此在進行培養中，保持細胞生存環境無污染、代謝物及時清除等，是維持細胞生存的基本條件。

細胞培養的溫度是維持培養細胞旺盛生長的另一條件，培養時要求有恒定適宜的溫度。人體細胞培養的標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡。

氣體也是人體細胞生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環，產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分。培養時一般把細胞置于95％空氣加5％二氧化碳混合氣體環境中。

二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養中的主要作用在于維持培養基的pH值。大多數細胞的適宜pH為7.2-7.4，偏離這一范圍對細胞培養將產生有害的影響。細胞培養液pH濃度的調節最常用的為加NaHCO₃的方法，因為NaHCO₃可供CO₂，但二氧化碳易于逸出，故最適用于封閉培養，而羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)因其對細胞無毒性，也起緩沖作用，有防止pH迅速變動的特性而用于開放細胞培養技術中，其最大優點是在開放式培養時能維持較恒定的pH值。

再者，細胞培養基既是培養細胞中供給細胞營養和促使細胞生長、增殖的基礎物質，也是培養細胞生長和繁殖的生存環境。培養基的種類很多，按其來源分為合成培養基和天然培養基。

(1)合成培養基：合成培養基是根據細胞所需物質的種類和數量嚴格配制而成的。內含碳水化合物、氨基酸、脂類、無機鹽、維生素、微量元素和細胞生長因子等。單獨使用時細胞雖能生存但生長增殖狀態不佳。

(2)天然培養基：使用最普遍的天然培養基是血清，以小牛血清應用最廣泛。血清由于含有多種細胞生長因子、促貼附因子及多種活性物質。與合成培養基合用，能使細胞順利增殖生長。常見使用濃度最為5-20％。

體外培養細胞根據它們在培養器皿中是否能貼附于支持物上的生長特征，可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類。貼附型細胞在培養時能貼附在支持物表面生長，常見的貼附型細胞是成纖維型細胞、上皮型細胞生長和游走型細胞。懸浮型細胞在培養中懸浮生長。

1、成纖維型細胞