[發明專利]一種脂肪多能細胞的分離及其培養方法

在審

• 申請號: 201710235638.7
• 申請日: 2017-04-12
• 公開（公告）號: CN108690828A
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 張繼崗;王灝川
• 申請（專利權）人: 上海聚仁生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 31230
• 代理人: 劉立平

1.一種脂肪多能細胞的培養方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)在無菌條件下獲取脂肪細胞和/或組織；

(2)將所述脂肪細胞和/或組織接種在培養基中培養，并在所述培養基中加入細胞生長調節劑，以使脂肪多能細胞生長，從而使所述脂肪細胞進入增殖狀態；以及

(3)培養所述脂肪多能細胞，使其持續增殖為具有干細胞特性的細胞。

2.根據權利要求1所述的脂肪多能細胞的培養方法，其特征在于，所述培養方法進一步包括：在步驟(3)后，增殖后的細胞在體外誘導的條件下，形成各種組織。

3.根據權利要求1所述的脂肪多能細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟(2)中將所述脂肪細胞和/或組織接種在培養基中培養包括如下步驟：

(2-A)將所述脂肪組織用含有至少兩種抗生素包括青霉素和鏈霉素的4℃預冷Hank氏緩沖鹽溶液(HBSS)連續洗滌至少2次，每次30秒至3分鐘；

(2-B)將所述脂肪組織置于含青霉素和鏈霉素的完全培養液中沖洗至少2次，每次30秒至3分鐘；

(2-C)將所述脂肪組織剪成器官型植塊，大小為1-5mm³；

(2-D)將所述植塊置于培養板的培養孔中央，間隔約1-5mm，按壓每塊植塊，使其緊貼培養板的表面；

(2-E)沿著培養孔的邊緣，每孔中加入0.1-1.0mL的完全培養液，勿使培養液與植塊接觸；

(2-F)將所述培養板置于37℃，5％CO₂培養箱中預孵育0.5-2小時；以及

(2-G)每個培養孔加完全培養液，切勿使植塊飄起，并且加入細胞生長調節劑。

4.根據權利要求1所述的脂肪多能細胞的培養方法，其特征在于：所述步驟(2)中將所述脂肪細胞和/或組織接種在培養基中培養包括如下步驟：

(2-a)將所述組織離散為單個細胞，首先將所述組織置入含有至少兩種抗生素包括：青霉素和鏈霉素的4℃預冷的HBSS中，洗滌至少3次，每次30秒至3分鐘，然后將所述組織切成1-5mm³的組織塊，再用含有青霉素和鏈霉素的冷HBSS洗滌兩遍，將經過洗滌的所述組織塊置入用無菌HBSS配制的0.1-0.5％中性蛋白酶溶液或者0.5-2％膠原酶溶液中消化，條件是36.5-37℃恒溫振蕩，時間0.5-3小時；

(2-b)用加樣器或者吸管反復吹打所述組織塊，或者將所述組織塊連同消化液一起傾倒至不銹鋼濾網上，用注射器栓研磨所述組織塊，直到所述組織塊完全離散，成為單個細胞為止，將含有細胞和消化酶溶液的混合物靜置2-8分鐘，棄去沉淀的塊狀物以及不易消化的結締組織，將含大量細胞和消化酶的上清液移至另一離心管，用不銹鋼濾網過濾所述上清液一次，得一消化酶和細胞混合物；

(2-c)在4℃條件下，1000-3000轉/分鐘，離心3-20分鐘，棄去含有消化酶的上清液，加0.5-6℃預冷HBSS旋渦振蕩將細胞旋起，再加0.5-6℃預冷HBSS，混勻；

(2-d)在0.5-6℃條件下，1000-3000轉/分鐘，離心3-20分鐘，棄去上清液，加冷HBSS旋渦振蕩將細胞旋起，再加0.5-6℃預冷HBSS，混勻，計數細胞；

(2-e)在0.5-6℃條件下，1000-3000轉/分鐘，離心3-20分鐘，棄去上清液，加含2-5％胎牛血清的α-MEM培養液，旋渦振蕩將細胞旋起，再加所述含2-5％胎牛血清的α-MEM培養液，并調整細胞濃度為1×10⁵個/mL，混勻，得到定量細胞懸液；加入細胞生長調節劑；

(2-f)將所述細胞懸液加至塑料多孔培養板中，其為96孔板、24孔板、12孔板或6孔板，96孔板每孔加200μl、24孔板每孔加1mL、12孔板每孔加2mL、6孔板每孔加4mL；以及

(2-g)將所述塑料多孔培養板置于36.5-37℃，5％CO₂細胞培養箱12-48小時，直至細胞全部貼壁。

5.根據權利要求1所述的脂肪多能細胞的培養方法，其特征在于所述脂肪的來源包括人的脂肪，小鼠脂肪，倉鼠脂肪，兔脂肪，牛脂肪和馬脂肪。