[發明專利]一種高效擴增NK細胞的方法

有效

• 申請號: 201710234419.7
• 申請日: 2017-04-11
• 公開（公告）號: CN108690829B
• 公開（公告）日: 2021-12-17
• 發明（設計）人: 李晨蔚;周春燕
• 申請（專利權）人: 上海尚泰生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;崔佳佳

本發明涉及細胞培養技術領域，本發明的培養方法培養的NK細胞純度高，數量大。本發明通過主要通過環孢素A、氫化可的松、IL?2、CS1單抗、IL?2、IL?15聯合使用來實現NK細胞的活化及擴增。本發明對具體的培養方法也進行描述，包含抗體的包被、NK細胞的活化及NK的擴增。本發明避免的飼養細胞的污染并且簡化了流程，最大程度的避免了污染；同時培養的NK細胞純度高，周期短，并且獲得的NK具有較高的殺傷活性。

技術領域

本發明涉及細胞培養技術領域，特別涉及一種NK細胞培養組合物及其培養方法。

背景技術

自然殺傷(Nature Killer，NK)細胞，是一種自然殺傷細胞，它是除T淋巴細胞、B淋巴細胞之外的第三類淋巴細胞。它作為人體第一道防線，能夠清除病毒、細菌等有害物質，同時還可以清除衰老、病變及癌變的細胞，從而維持人體的健康。

NK作為重要免疫效應細胞，不需要預先致敏即可直接殺傷病毒感染或異變的靶細胞，同時具有以下特征：1、無需特異性抗原識；2、直接殺傷靶細胞；3、不受MHC限制；4、具有較廣的抗瘤譜；5、基本無不良反應。在控制癌癥的發生和發展中起著非常重要的作用。其可以通過釋放穿孔素/顆粒酶、ADCC效應、Fas/FasL系統及NK細胞毒因子消滅人體內的病毒、細菌以及癌細胞。

過繼免疫治療已經成為腫瘤免疫治療的主要方式之一，它主要包括特異性的TIL、TCR、CAR-T、CAR-NK和非特異性的CIK、DC、NK等。正是由于以上NK其獨特的特點，其在腫瘤免疫治療中的應用越來越受到重視。研究顯示：衰老及腫瘤病人的的NK細胞數量降低而且活力也降低了。在日本，NK細胞不僅廣泛用于癌癥病人治療，還應用于亞健康人群，預防癌癥發生。因此，如何獲得大量的NK細胞成為目前亟待解決的問題。

目前，NK細胞的大量獲得仍然主要是通過與X射線輻射過的K562作為飼養細胞共培養獲得；或者是采用磁珠分選及流式分選。但是這些方法都有明顯的缺點。使用飼養絀胞無疑引入了外源性的細胞，增加了臨床應用的風險；而磁珠分選及流式分選操作繁瑣，無疑增加了細胞污染的風險，并且成本也較高。因此，研發一種低風險、低成本的NK細胞培養方法稱為一個亟待解決的問題。

發明內容

為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種無需滋養細胞激活NK細胞體外擴增活性技術，解決了外源性細胞引入的問題，增加了安全性；同時在本發明中無需通過流式分選及磁珠分選來純化NK細胞，簡化了操作流程且大大降低了成本。

本發明所采用的技術方案是：

對從外周血中分離PBMC細胞進行活化，活化后再進行擴增培養。主要包括以下幾個步驟：

(1)抗體包被

用PBS稀釋CS1單抗，并用稀釋好的單抗包被T75培養瓶，抗體包被濃度為10-60μg/mL.然后置于4℃孵育過夜或者37℃培養箱中孵育2h。

(2)PBMC分離及自體血清制備

使用Ficoll分離人血中的PBMC，并使用X-VIVO15培養基將PBMC的濃度調整至約1×10⁶個/mL。同時將分離得到的血漿于56℃進行滅活30min。然后離心后取上清并于4℃儲存備用。

(3)NK細胞活化培養

將分離后的細胞轉移至包被并用PBS清洗過的培養瓶中。然后加入IL-2、氫化可的松及環孢素A，它們的終濃度約為500-1000IU/mL、10^-4μM/L及50-100ng/mL。最后加入7-10％的自體血清。

(4)NK細胞的擴增培養