[發明專利]一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法

有效

• 申請號: 201710232692.6
• 申請日: 2017-04-11
• 公開（公告）號: CN106916848B
• 公開（公告）日: 2020-04-10
• 發明（設計）人: 張波;柳洪入;陳昆松
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

技術領域

本發明屬于植物分子生物技術和基因工程領域，涉及一種將目標基因在桃果實實現瞬時表達的方法。

背景技術

隨著越來越多植物基因組測序的完成，以及轉錄組測序技術的發展，功能基因的挖掘正在成為植物生物學研究的重要內容。轉基因技術是開展目標基因功能研究的主要手段。但是對于大多數植物，尤其是多年生果樹而言，除了蘋果、柑橘和葡萄等，大多數果樹尚未建立穩定的轉基因技術。轉基因技術的缺乏已經成為果樹功能基因挖掘的限制因子，也是影響果樹分子生物學發展的瓶頸因素。相對于轉基因技術的穩定表達特征，近年來發展了基于瞬時表達的功能基因篩選方法。隨著目前國際上日趨強調的基于同源物種的基因功能驗證，瞬時表達技術正得到越來越多的關注。

瞬時表達(transient expression)是指將目標基因通過特定的植物表達載體導入到植物活體內，在短時間內(可長達數天)表達，能夠準確反應基因的功能，在啟動子分析、蛋白互作和基因功能分析等方面用途廣泛。瞬時表達的轉化方法主要有農桿菌轉化法、基因槍轟擊法以及原生質體轉化法幾種。原生質體轉化方法對材料有很大限制，目前主要在擬南芥葉片與玉米原生質體及水稻懸浮細胞中實施?；驑屴Z擊法對設備的要求較高，且每次得到的植物組織質量少，難以滿足后續有關的生物學表型分析。農桿菌轉化法具有簡單快速、表達水平高和安全有效等特點。

基于農桿菌轉化技術的瞬時表達方法，雖然近幾年得到了不斷完善和發展，但是在果實上的成功應用依然有限。目前僅限于有腔室的番茄，以及果皮肥厚的柑橘。上述兩種果實的瞬時表達方法都是采用注射器直接注射農桿菌到果實組織實現的，但是該方法并不適合于果皮單薄、果肉組織沒有空腔的桃果實。

桃原產中國的全球性重要果樹，也是薔薇科植物研究的模式果實。目前，桃已經有了較為完善的基因組數據庫，需要從中篩選具有價值的基因并完成功能驗證。但是由于缺乏再生體系和轉基因技術，迫切需要在桃果實中發展基于瞬時表達技術的基因功能驗證方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法，用于基因的功能驗證研究，通過以下步驟實現：

1.桃果實成熟度的選擇：

選擇發育階段在綠熟期到商業采收期之間的成熟度果實最好，即選擇桃果實發育過程中的第一次快速膨大期結束到第二次快速膨大期結束期間的成熟度桃果實。

2.桃果肉組織切片的制作及預侵染的感受態培養：

(1)果實的消毒處理：選擇果型正常，無機械傷和病蟲害的果實進行后續實驗。果實洗凈去除表面污物,然后用50％的乙醇溶液消毒1min，再用有效氯含量在75-100mg·L^-1的次氯酸鈉水溶液浸泡20min消毒，最后用無菌水漂洗3-5次，在無菌狀態下晾干待用；

(2)果實切片的制作與預培養：選取距果實縫合線90°垂直的2個表面，成熟度較為一致的赤道面選取果肉部位，去除果皮組織后，將果肉組織切成為厚度為1cm面積大約為4-8cm²的小塊，由于果實大小差異，果肉的切片數目于大小有所變化，將制備好的果肉切片放置在MS固體培養基上，黑暗條件下預培養24-30h。預培養的條件是23℃，80-85％相對濕度。

3.將步驟2中得到的易感狀態的果肉切片浸泡于含目標基因的農桿菌和表面活性劑的侵染溶液，這些農桿菌細胞中含有目的基因的核苷酸序列：

(1)含有目標基因的農桿菌轉化培養：將目標基因構建到植物雙元表達載體PGreen002962-SK上，然后把重組質粒電轉入農桿菌GV3101：：pSoup，在含有卡那霉素(50mg/L)、慶大霉素(50mg/L)的固體培養基28℃培養2天后，挑選單克隆菌株，PCR檢驗后加入5ml含卡那與慶大抗生素的LB中，過夜培養后，擴大培養體系到500ml，培養至OD₆₀₀＝0.8-1.0，然后把菌液進行離心(4℃，5000g，10min)，待用；

(2)侵染溶液的制備：滲透液(10mM MES，10mM MgCI₂，150mM乙酰丁香酮，pH 5.6)中加入0.04％的表面活性劑混勻后，加入(1)中獲得的農桿菌菌液，經過重懸浮后，常溫放置2h，待用，表面活性劑可以選用三硅氧烷聚乙氧基化物或聚山梨醇酯20(20)，或辛基苯酚乙氧基化物(X-100)。

4.把目標基因轉入果肉組織：

將經過預誘導的果肉切片裝入網袋，置于含有步驟3的侵染溶液的容器中，然后抽真空至-70Kpa，保持壓強直到果肉組織表面氣泡滲出速度明顯下降，此過程大約需要1-5min。