[發明專利]一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法

有效

• 申請號: 201710232692.6
• 申請日: 2017-04-11
• 公開（公告）號: CN106916848B
• 公開（公告）日: 2020-04-10
• 發明（設計）人: 張波;柳洪入;陳昆松
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 趙杭麗

1.一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法，其特征在于，通過以下方法實現目標基因轉入桃果肉組織并瞬時過量表達：

(1)桃果實成熟度的選擇；

(2)桃果肉組織切片的制作及預侵染的感受態培養；

(3)將(2)中得到的易感狀態的果肉切片浸沒于包含農桿菌和表面活性劑的侵染溶液中，這些農桿菌細胞中含有目標基因的核苷酸序列SEQ：NO.1；

(4)把目標基因轉入果肉組織，向(3)中的溶液中施加壓強為-70Kpa的真空環境；

(5)緩慢釋放真空，使包含有目標基因的農桿菌細胞進入果肉；

(6)果肉組織侵染后的再培養，實現目標基因的瞬時過量表達。

2.根據權利要求1所述的一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法，其特征在于，步驟(1)選取成熟度的桃果實，以選擇在綠熟期到商業采收期之間的成熟度果實，即選擇桃果實發育過程中的第一次快速膨大期結束到第二次快速膨大期結束期間的成熟度果實。

3.根據權利要求1所述的一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法，其特征在于，步驟(2)桃果肉組織切片的制作與預侵染的感受態培養，通過以下步驟實現：

(a)果實的消毒處理：選擇果型正常，無機械傷和病蟲害的果實進行后續實驗，果實洗凈去除表面污物,然后用50％的乙醇溶液消毒1min，再用有效氯含量在75-100mg·L^-1的次氯酸鈉水溶液浸泡20min消毒，最后用無菌水漂洗3-5次，在無菌狀態下晾干待用；

(b)果實切片的制作與預培養：選取距果實縫合線90°垂直的2個表面，成熟度較為一致的赤道面選取果肉部位，去除果皮后，將果肉組織切成為厚度為1cm,面積大約為4-8cm²的小塊，將制備好的果肉切片放置在MS固體培養基上，黑暗條件下預培養24-30h，預培養的條件是23℃，80-85％相對濕度。

4.根據權利要求1所述的一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法，其特征在于，步驟(3)制備含有目標基因的侵染溶液，通過以下步驟實現：

(a)含有目標基因的農桿菌轉化培養：將目標基因構建到植物雙元表達載體PGreen002962-SK上，然后把重組質粒電轉入農桿菌GV3101：：pSoup，在含有卡那霉素、慶大霉素的固體培養基28℃培養2天后，挑選單克隆菌株，PCR檢驗后加入5ml含卡那與慶大抗生素的LB中，過夜培養后，擴大培養體系到500ml，培養至OD₆₀₀＝0.8-1.0，然后把菌液在4℃，10分鐘進行離心，待用；

(b)侵染溶液的制備：在滲透液中加入0.04％的表面活性劑混勻后，加入(a)中獲得的農桿菌菌液，經過重懸浮后，常溫放置2小時，得含有目標基因的侵染溶液，待用。

5.根據權利要求4所述的一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法，其特征在于，滲透液由10mM MES，10mM MgCI₂，150mM乙酰丁香酮組成，pH 5.6；表面活性劑選用三硅氧烷聚乙氧基化物，或聚山梨醇酯20，或辛基苯酚乙氧基化物。

6.根據權利要求1所述的一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法，其特征在于，步驟(4)利用真空滲透方式把目標基因轉入果肉組織，將經過預誘導的果肉切片裝入網袋，置于含有侵染溶液的容器中，抽真空至-70Kpa，保持壓強直到果肉組織表面氣泡滲出速度明顯下降，大約需要1-5min。

7.根據權利要求1所述的一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法，其特征在于，步驟(5)讓含有目標基因的侵染液能夠滲入果肉組織，這個過程大約需要15-20min。

8.根據權利要求1所述的一種在桃果實中實現基因瞬時表達的方法，其特征在于，步驟(6)將侵染后的果肉組織用無菌水漂洗3次，晾干后放入MS固體培養基在23℃培養2-3天，開展果肉組織中的目標基因表達檢測，實現目標基因的瞬時過量表達，其中培養條件為23℃，相對濕度80-85％。