[發(fā)明專利]一種茶葉鮮樣中游離氨基酸含量的快速分析方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710231647.9
• 申請(qǐng)日: 2017-04-11
• 公開（公告）號(hào): CN107091898A
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉騰飛;董明輝;張麗;楊代鳳;顧俊榮;范君;錢輝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): G01N30/74
• 分類號(hào): G01N30/74;G01N30/02
• 代理公司: 蘇州創(chuàng)元專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司32103
• 代理人: 馬明渡,楊超

1.一種茶葉鮮樣中游離氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：所述快速分析方法包括以下兩部分：

第一部分，配制溶液，再用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法建立已知梯度濃度的被測(cè)的游離氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立由以下步驟組成：

步驟（1），準(zhǔn)備氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品，分別為天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、組氨酸、甘氨酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、茶氨酸、胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸；

步驟（2），分別配制0.14 mol/L的磷酸鹽緩沖液、0.4mol/L的硼酸鹽緩沖液、0.8mg/mL的AQC衍生液、6種濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，6種濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各氨基酸的濃度為：

天冬氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

絲氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

谷氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

組氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

甘氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

精氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

蘇氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

脯氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

茶氨酸25μmol/L、50μmol/L、250μmol/L、500μmol/L、1000μmol/L、1250μmol/L；

胱氨酸2.5μmol/L、5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、125μmol/L；

酪氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

纈氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

蛋氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

賴氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

異亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

亮氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

苯丙氨酸5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L、250μmol/L；

步驟（3），對(duì)所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

移取6種濃度的所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，每種濃度的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液均取10μL，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，分別加入70μL所述硼酸鹽緩沖液，渦旋混合；分別取20μL所述AQC衍生液，在渦旋狀態(tài)下加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，渦旋混合，靜置后在50~55℃下加熱8~15min，取出冷卻至室溫，供分析用；

步驟（4），用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定衍生化的所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各氨基酸的色譜峰保留時(shí)間和色譜峰面積，以色譜峰保留時(shí)間定性，然后以所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的摩爾濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制出所述標(biāo)準(zhǔn)曲線；

其中，儀器分離條件為：

色譜柱：XBridge C18色譜柱（規(guī)格為3.9mm×15cm，4μm）；柱溫37℃；流速2.0mL/min；

熒光檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)250nm，發(fā)射波長(zhǎng)395nm；

流動(dòng)相：A為磷酸鹽緩沖液，按l:10的體積比用超純水稀釋；B為100%乙腈；C為100%超純水；梯度洗脫程序：0min，100%A；0.5min，98%A+2.0B%；0.5-9.0min，96.5%A+3.5%B；9.0-9.5min，95.0%A+5.0%B；9.5-11.5min，91.5%A+ 8.5%B； 11.5-13.0min，83.0%A+17.0%B，保持4min；17.0min，60.0%B+40%C，保持2min；19-23min，100%A；進(jìn)樣量10μL；

第二部分，測(cè)定茶葉鮮樣中所述第一部分中的18種游離氨基酸含量，包括以下步驟：

步驟（1），樣品制備；

取茶葉鮮樣攪碎并混合均勻，向茶葉鮮樣中加入沸水，所述茶葉鮮樣與所述沸水的投入比為向每1g茶葉鮮樣中投入40mL沸水，在88~92℃條件下浸提18~22min，冷卻至室溫后，2500~3500r/min離心4~6min，上清液加水定容10mL，過0.45μm微孔濾膜后得到茶鮮葉樣品溶液；

步驟（2），對(duì)所述茶鮮葉樣品溶液進(jìn)行衍生化反應(yīng)；

移取10μL茶鮮葉樣品溶液，置于自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，加入70μL所述硼酸鹽緩沖液，渦旋混合；取20μL所述AQC衍生液，在渦旋狀態(tài)下加入自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，渦旋混合，靜置后在50~55℃下加熱8~15min，取出冷卻至室溫，供分析用；

步驟（3），根據(jù)所述氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各氨基酸的色譜峰保留時(shí)間對(duì)所述茶鮮葉樣品溶液中游離氨基酸定性，使用外標(biāo)曲線法計(jì)算茶鮮葉樣品溶液中游離氨基酸的含量；其中，測(cè)定茶鮮葉樣品溶液中游離氨基酸的儀器分離條件與所述第一部分的步驟（4）中的儀器分離條件相同。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種茶葉鮮樣中游離氨基酸含量的快速分析方法，其特征在于：在所述第一部分的步驟（2）中，0.14 mol/L的磷酸鹽緩沖液的配制方法為：稱取19.0g三水醋酸鈉、1.72g三乙胺溶于1000mL水，用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.05，加EDTA，用0.45μm濾膜過濾；

0.4mol/L的硼酸鹽緩沖液的配制方法為：稱取12.36g硼酸，加400mL水溶解，用400g/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.8，然后加水稀釋至500mL；

0.8mg/mL的AQC衍生液的配制方法為：向1mgAQC粉末中加入1.25mL乙腈，渦旋混合，在55℃條件下加熱至溶解。