[發明專利]催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb及其編碼蛋白和應用

有效

• 申請號: 201710230581.1
• 申請日: 2017-04-10
• 公開（公告）號: CN106916838B
• 公開（公告）日: 2019-09-20
• 發明（設計）人: 高麗萍;代新龍;黃克依;趙貴福;趙月;石渝鳳;黎明;夏濤
• 申請（專利權）人: 安徽農業大學
• 主分類號: C12N15/61
• 分類號: C12N15/61;C12N9/90;C12P19/24;C12P19/02
• 代理公司: 北京市京大律師事務所 11321
• 代理人: 王凝;李洪群

本發明提供一種高效催化UDP?鼠李糖生物合成的基因CsRHMb、其編碼蛋白及工程菌，該基因是從茶葉鮮葉中分離并克隆獲得的，其編碼蛋白在以UDP?葡萄糖為底物，且在NADPH存在的反應體系中，該蛋白或由工程菌表達的重組蛋白能將UDP?葡萄糖高效轉化生成UDP?鼠李糖。本發明提供了一種高效安全的UDP?鼠李糖生物合成技術，利用生物工程方法優化了酶的最適反應條件，為實現UDP?鼠李糖的商品化生產提供了基礎。

技術領域

本發明涉及分子生物學及代謝工程學領域，具體地說，涉及一種高效催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb及其編碼蛋白和應用。

背景技術

茶葉作為一種無酒精飲料廣泛被世界各國人民接受和青睞。在茶樹中，多酚化合物主要以糖苷化形式存在于茶鮮葉中。而黃酮糖苷是茶樹中主要的次生代謝產物，多酚化合物與茶葉品質及人體保健密切相關。其中，黃酮醇及它們的衍生化產物如黃酮醇糖苷是決定茶葉品質和質量的重要組成成分。UDP-鼠李糖作為鼠李糖活化分子的一種重要的化合物，它不僅參與到植物細胞壁合成途徑中，而且作為黃酮醇糖苷合成前體物質。例如，蘆丁作為一種重要的黃酮醇糖苷，它的含量高低決定了茶湯滋味的好壞。UDP-鼠李糖作為蘆丁生物合成所必須的前體物質。UDP-鼠李糖不僅可作為黃酮糖苷生物合成的前體物質，更是多種藥用化合物合成必須物質。它在植物細胞壁的形成，化合物合成途徑中，科學研究等領域，都有著不可替代的作用。UDP-鼠李糖在植物體內的含量極低，其純化難度大，效率低等限制該化合物的獲得。利用現代化學合成手段也存在諸多問題，例如，合成成本高，過程繁瑣，并伴隨著污染環境的化學物質產生。因此，采用傳統方法很難純化合成出UDP-鼠李糖。迄今為止，市場上還沒有得到商品化的UDP-鼠李糖。而采用生物合成的方式，可以有效避免各種限制因素對UDP-鼠李糖合成的影響。

發明內容

本發明的目的是提供一種高效催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb及其編碼蛋白和應用。

為了實現本發明目的，本發明從茶葉鮮葉中分離并克隆獲得一種高效催化UDP-鼠李糖生物合成的基因CsRHMb，基因CsRHMb為：

i)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達相同功能蛋白質的核苷酸序列；或

iii)在嚴格條件下與SEQ ID NO：1所示序列雜交且表達相同功能蛋白質的核苷酸序列，所述嚴格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表達相同功能蛋白質的核苷酸序列。

本發明還提供由基因CsRHMb編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。基因CsRHMb編碼的蛋白在以UDP-葡萄糖為底物，且在NADPH存在的反應體系中，該蛋白或重組蛋白能將UDP-葡萄糖高效轉化生成UDP-鼠李糖。

本發明還提供含有所述基因CsRHMb的表達盒。

本發明還提供含有所述基因CsRHMb或所述表達盒的載體。優選地，出發載體為pMAL-c2X。

本發明還提供含有所述基因CsRHMb、所述表達盒或所述載體的工程菌、轉基因細胞系。

在本發明的一個具體實施方式中，將所述基因CsRHMb插入pMAL-c2X載體的多克隆位點中構建得到重組載體pMAL-c2X-CsRHMb，然后將重組載體轉化至大腸桿菌Novablue(DE3)中得到攜帶有基因CsRHMb的重組工程菌。

本發明還提供由所述基因CsRHMb編碼的蛋白，或者攜帶有所述基因CsRHMb的重組工程菌在催化UDP-葡萄糖合成UDP-鼠李糖中的應用。