[發明專利]一種基因敲除方法及其sgRNA片段與應用

有效

• 申請號: 201710230028.8
• 申請日: 2017-04-10
• 公開（公告）號: CN107043782B
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 沈以紅;于新波;黃先智
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;A01K67/04;C12N15/113
• 代理公司: 上海光華專利事務所(普通合伙) 31219
• 代理人: 尹麗云

本發明提供一種基因敲除方法及其sgRNA片段與應用，該基因敲除方法包括分別獲得表達Cas9和sgRNA的轉基因生物，再將兩種轉基因生物雜交，獲得共表達陽性個體。本發明簡化了載體構建技術，提高了注射效率，對靶標序列的編輯可以在受精完成后持續進行，因而保證了編輯效率。

技術領域

本發明涉及基因編輯技術領域，特別是涉及一種基因敲除方法及其sgRNA片段與應用。

背景技術

CRISPR/Cas9基因編輯技術是細菌和古細菌在噬菌體長期選擇壓力下進化出來的一種有效抵御外源DNA和病毒入侵的免疫機制，是由一段RNA通過堿基互補配對識別DNA，指導Cas9核酸內切酶切割識別的外源雙鏈DNA，誘發同源重組或非同源末端連接，進而實現在目的DNA上進行編輯。CRISPR-Cas系統對DNA分子的靶向切割特性，使其可以被用于定向的基因修飾。2012年，Doudan研究小組首次將crRNAs：tracrRNA二元復合體改造為單鏈RNA嵌合體，并指導Cas9蛋白在特定位點剪切。目前，CRISPR-Cas9已經在人類細胞、小鼠、斑馬魚、果蠅、擬南芥等生物中成功實現了基因組定點修飾。盡管ZFN、和TALEN技術也具有高效的基因編輯效率，但CRISPR/Cas9定點基因編輯方面有獨特優勢。首先，CRISPR/Cas9的靶點在基因組中分布頻率高，幾乎每8bp就有一個靶點，TALEN的靶點在基因組的分布頻率大概是1/125bp，而ZFN每500bp才有一個合適的靶點，CRISPR/Cas9系統更容易在需要突變的點附近篩選到高效的靶點。其次，CRISPR/Cas9在引入定點插入時比ZFN和TALEN具有更精確的優勢，這是由于Cas9切割DNA兩條鏈的功能分別屬于兩個功能域，通過突變其中的一個功能域使Cas9變成只切割一條鏈的切口酶，同時引入修復模板，這樣大大降低了天然Cas9切割雙鏈引入隨機突變的概率。因此，CRISPR/Cas9基因編輯技術在研究基因的功能方面具有得天獨厚的優勢。

但現有基因編輯技術的編輯效率較低，操作較為復雜，亟待改進。

發明內容

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種基因敲除方法及其sgRNA片段與應用，用于解決現有技術中基因編輯的效率較低等問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種基因敲除方法，包括分別獲得表達Cas9和sgRNA的轉基因生物，再將兩種轉基因生物雜交，獲得共表達陽性個體。

在本發明的一些實施例中，所述sgRNA含有如SEQ ID No.9、SEQ ID No.10所示序列中的至少一種。

在本發明的一些實施例中，所述生物為家蠶，家蠶的中文學名為桑蠶，拉丁學名Bombyx mori Linnaeus，是一種以桑葉為食料的鱗翅目泌絲昆蟲，屬無脊椎動物，節肢動物門蠶蛾科蠶蛾屬桑蠶種；將Cas9載體和sgRNA載體分別導入家蠶胚胎中，得到對應的目標轉基因家蠶，將獲得的目標轉基因家蠶雜交，獲得共表達陽性個體。

在本發明的一些實施例中，利用piggyBac重組表達載體將Cas9基因和sgRNA分別整合至家蠶基因組，含有Cas9基因的piggyBac重組表達載體由含有Cas9基因的表達盒插入到載體pBac[3×P3-EGFP]的BglⅡ酶切位點得到，含有sgRNA的piggyBac重組表達載體由含有sgRNA的表達盒插入到載體pBac[3×P3-DsRed]的BglⅡ酶切位點得到。