[發(fā)明專利]一種基因敲除方法及其sgRNA片段與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710230028.8
• 申請(qǐng)日: 2017-04-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107043782B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈以紅;于新波;黃先智
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/90;A01K67/04;C12N15/113
• 代理公司: 上海光華專利事務(wù)所(普通合伙) 31219
• 代理人: 尹麗云

1.一種基因敲除方法，其特征在于，包括：將Cas9基因插入到出發(fā)載體pSL1180的多克隆位點(diǎn)，得到中間載體，然后將完整的含有Cas9基因的表達(dá)盒IE1-Cas9-SV40插入到最終載體pBac[3×P3-EGFP]，得到重組表達(dá)載體pBac[3×P3-EGFP +IE1-Cas9-SV40]，將所述重組表達(dá)載體與輔助質(zhì)粒混合，將混合液注射至蠶蛾的卵中，孵化得到G0代蟻蠶，蟻蠶羽化成蠶蛾，蠶蛾回交或自交，得到G1代蛾圈，取G1代蛾圈中陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因系家蠶，培育至羽化，自交選純，獲得表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶；將家蠶內(nèi)源性脂肪酸去飽和酶基因BmDES3特異靶序列接入家蠶內(nèi)源性U6啟動(dòng)子后，再將sgRNA序列連接至U6啟動(dòng)子，獲得U6-sgRNA表達(dá)盒，將U6-sgRNA表達(dá)盒插入到載體pBac[3×P3-DsRed]，得到重組表達(dá)載體，將所述重組表達(dá)載體與輔助質(zhì)粒混合，將混合液注射至蠶蛾的卵中，孵化得到G0代蟻蠶，蟻蠶羽化成蠶蛾，蠶蛾回交或自交，得到G1代蛾圈，取G1代蛾圈中陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因系家蠶，培育至羽化，自交選純，獲得表達(dá)sgRNA的轉(zhuǎn)基因家蠶；將表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因家蠶與表達(dá)sgRNA的轉(zhuǎn)基因家蠶雜交，獲得共表達(dá)陽(yáng)性個(gè)體；所述sgRNA序列如SEQ ID No.9或SEQ ID No.10所示，所述U6啟動(dòng)子序列如SEQ ID No.6所示。