[發明專利]一種抗新加坡石斑魚虹彩病毒的藥物篩選方法

在審

• 申請號: 201710228784.7
• 申請日: 2017-04-10
• 公開（公告）號: CN107794291A
• 公開（公告）日: 2018-03-13
• 發明（設計）人: 易梅生;賈坤同
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及一種藥物篩選方法，尤其是一種基于細胞活性分析的抗新加坡石斑魚彩虹病 毒(SGIV)藥物篩選方法。

背景技術

新加坡石斑魚虹彩病毒(SGIV)隸屬于虹彩病毒科蛙病毒屬，是造成亞洲石斑魚水產養 殖業巨大經濟損失的主要病原體之一。雖然SGIV感染石斑魚給養殖者造成了嚴重的經濟損 失，但是目前可用來治療SGIV的方法卻十分有限。目前，有兩種SGIV疫苗被證明能有效 的降低石斑魚被SGIV感染的風險，包括福爾馬林滅活疫苗和β-丙內酯滅活疫苗。但是，給 魚，尤其是幼魚，接種疫苗既費時又繁瑣，導致這些疫苗很難普及及商業化。因此，迫切需 要開發其他有效的抗SGIV的方法。

小分子化合物是一種與許多生物過程相關的低分子量有機化合物，比如，新陳代謝，信 號轉導和免疫。多種小分子化合物已經被證明能作為抗病毒藥物，通過不同機制有效對抗病 毒感染。雖然有許多證據顯示小分子化合物在人類或其他動物體內有抗多種病毒的作用，但 目前仍然沒有關于抗SGIV的小分子藥物的報導。

抗病毒化合物的鑒定需要可靠的篩選方法。目前已有多種篩選方法用于抗病毒藥物的篩 選，比如細胞病變效應的分析，基因組或亞基因組復制子的分析，空斑形成實驗和熒光標記 的重組病毒檢測。但是這些方法存在過程復雜，分析復雜等問題。

發明內容

本發明的目的是提供一種簡單有效的抗SGIV藥物的篩選方法，首次應用定量SGIV感 染引起的致細胞病變效應(CPE)可以被量化，優化了抗SGIV藥物篩選的細胞篩選體系， 并利用ddPCR對藥物篩選結果進行定量的描述。

一種基于細胞活性分析的抗SGIV藥物篩選的細胞篩選體系，包括：血清濃度5％，當需 要添加DMSO為溶劑時，DMSO濃度不高于1％，病毒感染復數為0.3，病毒感染時間為48h。

一種基于細胞活性分析的抗SGIV藥物篩選的細胞篩選體系的優化方法，包括以下步驟：

1、定量SGIV感染引起CPE，確定感染復數及感染時間；

2、基于CPE的細胞活性培養條件的優化。

一種基于所述細胞篩選體系的抗SGIV藥物篩選方法，包括以下步驟：

1、體外篩選細胞株的建立及細胞培養；

2、病毒感染所述細胞株及細胞培養；

3、被篩選藥物的添加及細胞培養；

4、通過檢測細胞活性進行藥物篩選。

優選的，所述步驟1中的細胞株可以為任意魚類細胞株，進一步的，本申請還保護一種 基于體外細胞活性分析的抗SGIV藥物篩選的斑馬魚胚胎細胞株ZEB(Danio rerio ZEB)，于 2017年1月9日保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武漢市武昌珞珈山，武漢大學，保藏編號為C201708。

優選的，所述步驟1、2、3的細胞培養使用的培養基為DMEM培養基，血清濃度5％， 當需要添加DMSO為溶劑時，濃度不高于1％。

優選的，步驟2中所述病毒感染時病毒感染復數為0.3，病毒感染時間為48h。

優選的，本發明所述藥物篩選方法還包括使用ddPCR對藥物篩選結果的檢測，具體為使 用ddPCR來檢測SGIV基因編碼的衣殼蛋白(MCP)復制數量來定量檢測篩選藥物的效果。

進一步的，ddPCR來檢測SGIV基因編碼的衣殼蛋白(MCP)復制數量的計算公式為：

CNMCP＝count MCP/count actin＝MCP數量/肌動蛋白數量。

本發明的有益效果是：

本發明方法的優點在于首次應用定量SGIV感染引起的致細胞病變效應(CPE)可以被 量化，優化了抗SGIV藥物篩選的細胞篩選體系，并利用該體系建立了簡單的篩選方法，使 用ddPCR用于篩選結果的檢測，準確快捷。

附圖說明

圖1為定量SGIV感染引起的CPE數據；

圖2為不同條件下培養的細胞CPE數據；

圖3為不同條件下細胞活性數據；

圖4為不同條件下的CPE數據；

圖5為不同條件下ddPCR結果。

具體實施方式

下面通過具體的實施例對本發明的技術方案進行詳細的說明，但是本發明的范圍不受這 些實施例的限制。

實施例中，以斑馬魚胚胎細胞株ZEB(Danio rerio ZEB)為例。ZEB細胞用含10％胎牛血 清(FBS)的DMEM培養基于28℃培養。SGIV在ZEB細胞繁殖擴增后收集，于-80℃保存。