[發明專利]一種利用定點突變及酶切技術制備熒光分子量內標的方法

在審

• 申請號: 201710228420.9
• 申請日: 2017-04-10
• 公開（公告）號: CN106868001A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 榮海博;管樺;姜伯瑋;阮德林;張濤;金川;王峰;張黎明
• 申請（專利權）人: 公安部第一研究所;北京中盾安民分析技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種利用定點突變及酶切技術制備熒光分子量內標的方法。

背景技術

分子量內標是在進行STR檢測時與樣品在同一通道電泳的一系列長度不同的DNA片段，在數據分析時，通過分析樣品DNA與分子量內標的相對出峰位置，就可以標定樣品DNA的大小。在電泳時，分子量內標的出峰時間和峰型也可以反映電泳儀器的工作狀態。

中國專利CN101050474(公開日：2007.10.10)公開的一種分子量內標的制備方法及用該方法制備的分子量內標，CN 105296473A(公開日：2016.02.03)公開的一種分子量內標及其應用，CN106282180A(公開日：2017.01.04)公開的一種分子量內標及其制備方法和應用》，三個技術方案都采用了PCR擴增技術對模板進行擴增，通過固定上游引物，依次向下設計下游引物的方法得到一系列長度不等的片段，如圖1所示。然而，采用這種方法需要摸索PCR擴增條件，擴增產物容易有非特異性條帶，并且制備的分子量內標穩定性差。上述方法中，由于引物二聚體的長度與內標中的小片段長度相近，不易于純化，因此混有引物峰，容易在數據分析時產生誤判，且不易于規模化生產。

目前尚無文獻報道利用定點突變及酶切技術制備熒光分子量內標的方法。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明旨在提供一種利用定點突變及酶切技術制備熒光分子量內標的方法，實現制備從50bp到500bp共14個片段的分子量內標，制備的產物沒有引物峰等雜峰，且制備工藝適用于規模化生產。

一種利用定點突變及酶切技術制備熒光分子量內標的方法，包括如下步驟：

S1將目的DNA片段A克隆進質粒載體，得到重組質粒B；

S2以步驟S1中得到的重組質粒B為模板，在DNA片段A的不同長度位置分別進行定點突變，引入限制性酶切位點，并得到相應的重組質粒C；

S3設計DNA片段A的擴增引物F1、R1，并分別在引物5’端進行熒光標記；

S4利用擴增引物F1、R1擴增重組質粒C，得到擴增產物D，將產物D進行純化；

S5利用限制性內切酶酶切純化后的擴增產物D，得到酶切產物E，即熒光分子量內標。

需要說明的是，步驟S1中，DNA片段A長度為10bp到5000bp。

需要說明的是，步驟S2中，所述限制性酶切位點為黏性末端的酶切位點或者平末端的酶切位點。

進一步需要說明的是，步驟S2中，所述限制性酶切位點為BamHI、HindIII、EcorV或EcorI。

需要說明的是，步驟S3中，熒光標記為能與DNA堿基結合并能被488nm-605nm激光激發出熒光的物質。

進一步需要說明的是，所述熒光標記為ROX、HEX、FAM、CY3、CY5或LIZ。

本發明的有益效果在于：利用本發明方法可以實現制備從50bp到500bp共14個片段的分子量內標，制備的產物沒有引物峰等雜峰，且制備工藝適用于規模化生產，對獲得的內標片段進行線性化分析，R值＝0.9999，符合線性化要求，可以用作STR分型的分子量內標。

附圖說明

圖1為現有方法的實施流程示意圖；

圖2為本發明的實施流程示意圖；

圖3為本發明實施例中的分子量電泳檢測圖；

圖4為本發明實施例中的分子量內標線性分析圖。

具體實施方式

以下將結合附圖對本發明作進一步的描述，需要說明的是，本實施例以本技術方案為前提，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍并不限于本實施例。

如圖2所示，一種利用定點突變及酶切技術制備熒光分子量內標的方法，包括如下步驟：

S1將目的DNA片段A克隆進質粒載體，得到重組質粒B；

S2以步驟S1中得到的重組質粒B為模板，在DNA片段A的不同長度位置分別進行定點突變，引入限制性酶切位點，得到相應的重組質粒C；

S3設計DNA片段A的擴增引物F1、R1，并分別在引物5’端進行熒光標記；

S4利用擴增引物F1、R1擴增重組質粒C，得到擴增產物D，將產物D進行純化；

S5利用限制性內切酶酶切純化后的擴增產物D，得到酶切產物E，即熒光分子量內標。

需要說明的是，步驟S1中，DNA片段A長度可以為但不限于10bp到5000bp。

需要說明的是，步驟S2中，所述限制性酶切位點為黏性末端的酶切位點或者平末端的酶切位點。