[發明專利]一種利用配對微流控芯片高通量分析單細胞內含物的方法

有效

• 申請號: 201710228304.7
• 申請日: 2017-04-10
• 公開（公告）號: CN107012220B
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發明（設計）人: 楊朝勇;鄒遠;張明霞;朱志
• 申請（專利權）人: 杭州微著生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6834;C12Q1/02
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;游學明

1.一種利用配對微流控芯片高通量分析單細胞內含物的方法，所述方法包括如下步驟：

首先提供一微流控芯片，該微流控芯片包括捕獲層、控制層、載片三部分；捕獲層包括兩個并行的流道（10，11）和連接通道（13），控制層包括隔離通道（12）；其中每個捕獲通道由多個捕獲單元（8，9）首尾串接而成，每個單元包括流道（10，11）、儲液腔室（14，15）、捕獲通道（16，17）三部分，流道（10，11）包括U形管，前一單元U形管的左臂端連接后一單元U形管的右臂端，儲液腔室（14）位于U形的兩臂之間，且設有三條通道，第一通道直徑大于待捕獲的單微球/單細胞，通往U形管的液體進口端，第二通道為捕獲通道，直徑小于捕獲的單微球/單細胞，通往Ｕ型管的液體出口端；第三通道為連接通道（13），直徑小于捕獲的單微球/單細胞，通往并行的另一捕獲單元的儲液腔室；

連接通道（13）連接兩個捕獲單元的儲液腔室（14，15）；隔離通道（12）層位于連接通道（13）下方或上方，垂直于連接通道（13）并由隔膜（18）隔離開；兩個流道分別含有一個樣品入口（1，2）、一個油相入口（4，5）以及一個出口（6，7），隔離通道含有一個入口（3）；

a、在隔離泵入口（3）注滿溶液，增加注射泵壓力，隔離通道（12）形變，隔膜（18）擠壓連接通道最上層，直到連接通道（13）被完全阻斷開，從通道入口（1）用注射泵通入細胞懸浮液，各捕獲單元（8）捕獲單細胞；

b、保持連接通道（13）關閉狀態，在微球通道入口（2）用注射泵通入微球懸浮液，在并行的另一個微球通道中實現高通量單微球的捕獲；

c、保持連接通道（13）關閉狀態，分別細胞通道入口（1）和微球通道入口（2）通入清洗溶液，洗去通道中殘余的細胞和微球；

d、保持連接通道（13）關閉狀態，細胞通道入口（1）繼續通入清洗溶液或者反應溶液A，在微球通道入口（2）通入細胞裂解液或者反應溶液B，將微球通道和捕獲腔室的清洗溶液替換為相應的反應溶液；

e、保持連接通道（13）關閉狀態，將細胞入口（1）打開，關閉出口（7），在入口（4）用注射泵通入油相，儲液腔室內形成一個油包水的液滴，液滴中含有單細胞，從而將單個細胞隔離在儲液腔室中；

f、保持連接通道（13）關閉狀態，將微球入口（2）打開，關閉出口（6），在入口（5）用注射泵通入油相，儲液腔室形成一個油包水的液滴，液滴中含有單微球，形成獨立的反應單元；

g、關閉隔離泵，此時連接通道（13）被打開，此時并行通道中包裹微球/細胞的配對液滴聯通，由于擴散作用，微球儲液腔室（15）里面的細胞裂解液或者反應溶液B擴散到細胞儲液腔室（14）將細胞裂解，釋放單細胞中的內含物，且內含物通過擴散作用進入微球捕獲腔室，與反應溶液A和微球一起充分接觸后被捕獲或者反應，單細胞中的內含物反應后被微球全部捕獲，完成所有單微球對與其配對的單細胞的內含物的單獨捕獲；

h、打開細胞通道出口（7）和微球通道出口（6），再從兩個通道入口（1，2）分別通入洗滌溶液，將未被捕獲的其他物質洗去；將捕獲層與控制層剝離開，回收捕獲通道中的微球，然后再次用洗滌溶液清洗微球，進一步除去溶液中未結合的其他物質；

i、配制連接酶反應溶液，將微球分散在酶反應溶液中，將微球上的編碼信息與所捕獲的內含物通過酶反應連接在一起形成編碼內含物信息，用洗滌溶液對清洗完成酶反應的微球進行洗滌；

j、外切酶切割：配制核酸外切酶I反應溶液，將經過酶反應的微球分散在核酸外切酶I反應溶液中反應，切割去掉多余的單鏈編碼引物，保留編碼內含物信息，然后用洗滌溶液洗滌微球，將微球分散在緩沖溶液中；

k、建庫測序：配制PCR反應溶液，將微球分散在PCR反應溶液中對編碼內含物信息進行PCR擴增，微球上的編碼內含物信息被擴增到溶液中，對擴增產物進行純化并定量；用純化后的擴增產物進行DNA文庫構建并測序；

l、生物信息學分析：分析得到的高通量測序結果，根據編碼分析物信息對單細胞中的內含物進行定量分析，繪制針對內含物的單細胞分子生物學圖譜。

2.根據權利要求1所述的一種利用配對微流控芯片高通量分析單細胞內含物的方法，其特征在于：待分析的單細胞內含物為轉錄組、基因組、miRNA、蛋白組、甲基化DNA、代謝產物、脂質體或磷脂中的至少一種。