[發(fā)明專利]一種利用配對微流控芯片高通量分析單細胞內含物的方法

有效

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• 申請日: 2017-04-10
• 公開（公告）號: CN107012220B
• 公開（公告）日: 2019-11-05
• 發(fā)明（設計）人: 楊朝勇;鄒遠;張明霞;朱志
• 申請（專利權）人: 杭州微著生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6834;C12Q1/02
• 代理公司: 廈門市首創(chuàng)君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;游學明

本發(fā)明涉及一種利用配對微流控芯片高通量分析單細胞內含物的方法。所述的配對微流控芯片為高通量捕獲單微球/單細胞的微流控芯片，所述的方法包括：a、高通量配對捕獲單微球/單細胞；b、對配對單元平行操控，如對大量單細胞的隔離、培養(yǎng)、裂解等，單細胞各種內含物的捕獲等；c、通過編碼微球將單細胞內含物信息轉化為DNA序列信息，利用高通量測序技術和生物信息學方法分析大量單細胞內含物，如轉錄組、基因組、miRNA、蛋白組、甲基化DNA、代謝產物、脂質體、磷脂等。本方法可以全面完整的分析單細胞內含物信息，具有通量高，準確性高，成本低，可分析靶標廣等優(yōu)點。

技術領域

本發(fā)明涉及分子細胞生物學，具體涉及一種利用配對微流控芯片高通量分析單細胞內含物的技術。

背景技術

分析細胞內含物是分子生物學研究的基礎，也是現(xiàn)代醫(yī)療診斷的分析靶標。傳統(tǒng)分析細胞內含物的方法對大量細胞平均信號的分析處理使得信號的平均化模糊了人們對單細胞之間異質性的認識。目前前沿生物學研究和醫(yī)學研究表明，同一個體的不同組織之間，同一組織的不同部位之間，以及同一部位的不同細胞之間都存在異質性(heterogeneity)，即使是同一種細胞的不同個體之間也可能存在很大的異質性，這差異最大的這些細胞往往能夠揭示重要生物學現(xiàn)象或者提示癌癥等重大疾病。因此單細胞的全面分析是現(xiàn)代生物學和醫(yī)學研究十分需要的技術。

對單細胞分析來說，其面臨的挑戰(zhàn)主要有三點，首先是快速高效地分離單細胞，防止單細胞的丟失；其次是由于單細胞中所含有的分析靶標量太少，如何無偏放大靶標的信號，減少或者消除放大偏差性，真實反應細胞內含物的表達水平；再次是提高單細胞分析的通量，減少重復操作，提高效率；最后是如何實現(xiàn)單細胞內含物的全面分析，分析各種內含物的表達量以及相互之間的關聯(lián)。

目前尚無能夠將高通量捕獲單細胞、無偏擴增微量單細胞內含物、全面分析單細胞內含物集成在一起的公開技術。但已有公開報道利用微流控技術高通量分析單細胞轉錄組。比如Cell文章(Macosko et al.，2015,Cell：161，1202-1214；Klein et al.,2015,Cell161,1187-1201)報道的結合液滴微流控和編碼微球的方法，基于泊松分布原理利用液滴微流控的方法配對捕獲單細胞與單微球，單細胞裂解釋放的mRNA被與之配對的編碼微球捕獲，再經過逆轉錄和擴增，將單細胞mRNA信息編碼與放大，通過高通量測序與生物信息學方法分析大量大細胞mRNA的表達情況。該方法中細胞與微球的捕獲是基于泊松分布原理，大部分的液滴沒有細胞，只有～1％的液滴含有單個細胞，再結合微球的泊松分布，有效分析目標進一步減少，只能實現(xiàn)對大量實際樣品中少部分細胞的分析，這樣可能會忽略掉樣品中一些重要的細胞個體。另外該策略只適合分析對象數(shù)目較多的樣品，對于一些稀有細胞(比如循環(huán)腫瘤細胞)，由于其樣品中細胞數(shù)量太少(10-100/mL血液)，無法用該方法來實現(xiàn)單細胞分析。這些技術都僅限于分析單細胞的mRNA，其他單細胞內含物無法進行分析，如基因組、miRNA、蛋白組、甲基化DNA、代謝產物、脂質體、磷脂等。目前公開的技術中，都沒有涉及到高通量分析。

發(fā)明內容

針對現(xiàn)有技術的缺陷，為了解決以上問題，本發(fā)明的目的在于：利用申請人發(fā)展的配對微流控芯片，基于流體力學原理和尺寸效應高通量捕獲單細胞，結合編碼技術和高通量測序技術，提供一種高通量分析單細胞內含物的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：

本發(fā)明公開了一種利用配對微流控芯片高通量分析單細胞內含物的方法，所述方法包括步驟：