[發明專利]海洋微生物脂肪酶YS2071的固定化方法

在審

• 申請號: 201710228123.4
• 申請日: 2017-04-10
• 公開（公告）號: CN108690842A
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發明（設計）人: 王躍軍;孫晶晶;劉均忠;郝建華;馬子賓;孫謐
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12N11/08
• 分類號: C12N11/08;C12N9/20
• 代理公司: 北京方安思達知識產權代理有限公司 11472
• 代理人: 陳琳琳;武玥

本發明涉及海洋微生物低溫脂肪酶YS2071的固定化方法,包括脂肪酶YS2071溶液的配制、固定化載體環氧樹脂的處理以及固定化,得到固定化脂肪酶YS2071。該固定化方法操作簡單，條件溫和,固定化脂肪酶YS2071兼備吸附和共價連接的獨特特點和優異特性,并具有高效、穩定、酶活率保留高的固定化方法。固定化脂肪酶YS2071是一種重要的生物催化劑，它在能源領域，食品工業、洗滌劑、油脂工業、醫藥工業等領域都有重要的應用。

技術領域

本發明涉及海洋微生物酶固定化領域，特別是涉及海洋微生物脂肪酶YS2071的固定化方法。

背景技術

脂肪酶基本上存在于所有的生物體中，它在對脂類(如甘油三酸酯、脂肪、油等)的消化、運輸和剪切中發揮著關鍵作用。脂肪酶能夠催化酯類的水解反應、醇解反應、酯化反應以及水解的逆向合成等多種反應，具有穩定性高、底物特異性廣泛、催化活性高且副反應少等特點，是一種重要的生物催化劑。因此，脂肪酶在能源領域，食品工業、洗滌劑、油脂工業、醫藥工業等諸多領域都有重要的應用。

海洋微生物為適應海洋這一生命極限環境，海洋微生物酶表現了比陸源微生物酶更為獨特的生理功能與酶學特性，其開發應用潛力巨大，愈來愈引起世界各國的重視與開發。脂肪酶作為一種綠色生物催化劑，具有高催化活性、副反應少、低污染、操作穩定性高等一系列優點，然而，脂肪酶在實際工業應用中，自身也存在一些局限性：在高溫、有機溶劑、強酸\堿等條件下不夠穩定，易變性失活，對環境的耐受性差；易被降解,反應過程中易發生聚團現象,與底物難以充分接觸。游離脂肪酶價格比較高,而且一般只能催化一次反應，無法從反應體系中回收和重復利用，使得產品的生產成本大大提高，限制其在工業實踐中的廣泛應用。

而酶的固定化技術極大的擴展了酶的應用范圍。固定化酶是通過適當的方法將酶固定在一定的空間內，在保持其自身特性的同時能夠實現回收和重復利用。固定化酶的出現解決了游離酶實際應用中的諸多局限。因此，開發新型脂肪酶和研究脂肪酶的固定化技術是十分迫切的。酶的固定化可以擴大生物催化技術的應用和使酶容易分離從反應混合物中回收用于下一步反應。此外，酶的固定化還可以提高其熱穩定性和化學穩定性和抵抗外界極端變化條件。常用的固定化方法有物理吸附，包埋，交聯和共價連接。其中，吸附法是最簡單的固定化方法，直接將酶吸附固定到載體上，操作簡單，條件溫和，避免了化學修飾造成的活性中心和酶的高級結構的破壞，可保持較高的酶活力，但穩定性較差，在極端環境(高溫，極端pH)中易解離。共價連接法是最穩定的固定化方法，是利用共價鍵將酶分子和載體進行連接，穩定性較高，但共價連接可能覆蓋酶的活性位點使酶的活性降低,所以開發新的海洋脂肪酶固定化體系成為目前關住的中心。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術存在的不足，經發明人長期開發研究海洋微生物及其酶產物和生產實踐，開發提供一種兼備吸附和共價連接的獨特特點和優異特性,并具有高效、穩定，酶活率保留高的海洋微生物低溫脂肪酶YS2071的固定化方法。

本發明提供一種海洋微生物低溫脂肪酶YS2071的固定化方法,包括下列步驟:1)、配制脂肪酶YS2071酶液

將海洋微生物脂肪酶YS2071(簡稱脂肪酶YS2071)酶粉，溶于0.02mol/L由磷酸氫二鉀4.76g，磷酸二氫鉀0.55g，加入去離子水溶解，定容到1L配制的緩沖液中，4℃下攪拌均勻后，8000r/min高速離心5min，將上清轉移到容量瓶中，用上述緩沖液定容后，得到脂肪酶YS2071酶液，其中,脂肪酶的活性為486U/g脂肪酶的濃度為2mg/mL，4℃。

2)、固定化載體環氧樹脂的處理

將固定化載體環氧樹脂(如LX-1000EP)先用95wt％的乙醇浸泡，24h后抽濾，再用去離子水沖洗洗凈至無乙醇味道，最后用丙酮浸泡一段時間后，用去離子水洗凈至pH 7.0。

3)、脂肪酶YS2071的固定化