[發(fā)明專利]一種細(xì)胞擴(kuò)增的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710227450.8
• 申請(qǐng)日: 2017-04-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107151655A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張斌;李猛;陳虎;趙龍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍第三O七醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N5/0789
• 分類號(hào): C12N5/0789;C12N5/0775
• 代理公司: 北京市振邦律師事務(wù)所11389
• 代理人: 汪妍瑜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細(xì)胞擴(kuò)增領(lǐng)域，特別是造血干細(xì)胞系包擴(kuò)增領(lǐng)域.

背景技術(shù)

自1989^[1]年第一例臍帶血移植開(kāi)展以來(lái)，臍帶血作為造血干細(xì)胞(hematopoieticstem cells,HSCs)的重要來(lái)源一直備受關(guān)注，臍帶血移植的優(yōu)勢(shì)在于其不需要嚴(yán)格的人類白細(xì)胞主要抗原(human leukocyte antigen,HLA)配型，對(duì)供者無(wú)傷害且不存在倫理問(wèn)題，感染風(fēng)險(xiǎn)小，可冷凍保存使用便捷^[2,3]等。制約其在臨床中大量應(yīng)用的最主要障礙在于臍帶血中HSCs的數(shù)量有限，移植后會(huì)導(dǎo)致造血恢復(fù)延遲，感染風(fēng)險(xiǎn)增加等問(wèn)題^[4]。而雙份臍帶血移植則會(huì)增加移植的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致植入延遲等問(wèn)題出現(xiàn)，且會(huì)增加患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)^[5]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外一直嘗試對(duì)臍帶血來(lái)源造血干祖細(xì)胞(hematopoietic stemprogenitorcells,HSPCs)進(jìn)行體外擴(kuò)增，以解決其細(xì)胞數(shù)量不足的問(wèn)題。目前HSPCs擴(kuò)增技術(shù)主要有細(xì)胞因子擴(kuò)增技術(shù)，化學(xué)分子擴(kuò)增技術(shù)，聯(lián)合培養(yǎng)擴(kuò)增技術(shù)以及三維培養(yǎng)系統(tǒng)的應(yīng)用^[6]。涉及臍血源HSPCs擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段，并證實(shí)了擴(kuò)增后HSPCs的安全性及有效性^[7]，但最佳的擴(kuò)增條件至今尚沒(méi)有明確的共識(shí)。

造血微環(huán)境在HSCs的成長(zhǎng)分化過(guò)程中扮演重要角色，體外培養(yǎng)過(guò)程中能否更有效的模擬造血微環(huán)境，是決定HSPCs體外擴(kuò)增效果的重要先決條件。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchyma stem cell,MSC)作為造血微環(huán)境的重要組成部分，可以分泌造血生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，為HSPCs的增殖提供信號(hào)，研究表明其與HSPCs共培養(yǎng)可以顯著提高擴(kuò)增效率^[8]。UM 171是造血干細(xì)胞龕中篩選出的選擇性的人HSCs再生激動(dòng)劑，可以選擇性的增加長(zhǎng)期HSPCs的再生^[9]。鑒于以上結(jié)果，為更有效的模擬造血微環(huán)境，本發(fā)明采用與臍血同源的MSC與UM171聯(lián)合應(yīng)用于臍血HSPCs的體外擴(kuò)增培養(yǎng)，取得了較好的效果，目前該方法國(guó)內(nèi)外均無(wú)相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

附圖說(shuō)明

圖1是倒置顯微鏡下觀察MSCs及CD34⁺細(xì)胞培養(yǎng)形態(tài)，a為MSC貼壁培養(yǎng)細(xì)胞照片(X200)；b為UM171組培養(yǎng)細(xì)胞照片(X40)

圖2是流式細(xì)胞儀對(duì)MSCs表面抗原檢測(cè)結(jié)果

圖3是光學(xué)顯微鏡下觀察MSCs分化誘導(dǎo)成像(X200)，a圖為MSCs成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞照片；b圖為MSCs成脂誘導(dǎo)后細(xì)胞照片；c圖為成軟骨誘導(dǎo)后細(xì)胞照片。

圖4是各組培養(yǎng)過(guò)程不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞總數(shù)變化情況

圖5是各組細(xì)胞培養(yǎng)后流式檢測(cè)情況

圖6是細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)圖a圖為對(duì)照組凋亡流式檢測(cè)圖；b圖為聯(lián)合組凋亡流式檢測(cè)圖

圖7是倒置顯微鏡下觀察各譜系集落形成(X200)，其中a圖為CFU-E；b圖為BFU-E；c圖為CFU-GM；d圖為CFU-GEMM

具體實(shí)施方式

一、材料

1.標(biāo)本采集：實(shí)驗(yàn)用臍帶及臍血均源自307醫(yī)院產(chǎn)科，報(bào)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理編號(hào)KY-2016-8-36)并征得產(chǎn)婦及家屬同意。健康足月順產(chǎn)產(chǎn)婦娩出胎盤后，無(wú)菌剪刀采集臍帶30cm，并收集于相應(yīng)臍血儲(chǔ)存于臍血采集袋中。