[發明專利]一種用于檢測電子煙制品對細胞脂質過氧化影響的方法

在審

• 申請號: 201710226543.9
• 申請日: 2017-04-09
• 公開（公告）號: CN107460227A
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 管瑩;夭建華;李雪梅;熊國行;米其利;高茜;朱洲海
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京權泰知識產權代理事務所(普通合伙)11460
• 代理人: 任永利

技術領域

本發明屬于煙草制品生物學效應評價技術領域，特別涉及一種用于檢測電子煙制品對細胞脂質過氧化影響的方法。

背景技術

隨著人們對健康的關注越來越高，對煙草產品提出了更高的要求，不但要有較好的口感，而且要盡可能的減少人體的不良感受。電子煙制品避免了傳統卷煙制品燃燒所產生的復雜混合物所帶來的危害，現階段已成為國外煙草公司從傳統卷煙制品轉向的新方向之一。電子煙制品其使用過程中通過電加熱或者電子霧化方式使由煙堿、香味物質等組成的液體轉化為類似于卷煙煙霧的混合物，再將霧化后的丙三醇/尼古丁等混合“煙霧”傳送至消費者，使人吸入劑量不等的尼古丁而獲得類似于抽吸傳統卷煙的生理感受。電子煙研發人員在煙油產品配方設計初期將不同組份按照不同比例組合調配，形成具有不同風格的初選配方，再結合化學評價和感官評價對配方進行不斷篩選調整形成最終的產品配方。然而初選配方數量眾多，全部進行感官評價耗時耗力，且感官評價側重于對產品的風格口感進行篩選，如何利用生物學測試指標對產品初選配方進篩選，以獲得降低人體不良感受的產品配方，目前尚屬探索階段，無統一的標準方法。

機體在遭受各種不利刺激時，體內高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)產生過多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。這種現象被稱為氧化性損傷，氧化性損傷是一種廣譜性損傷機制，丙二醛(MDA)是脂質過氧化的一種重要效應生物標志物，對其進行測定，可用于產品初選配方的進一步篩選，以獲得降低人體不良感受的產品配方。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測電子煙制品對細胞脂質過氧化影響的方法，為電子煙制品的安全性評估提供參考。

本發明公開一種用于檢測電子煙制品對細胞脂質過氧化影響的方法，包括以下步驟：

(1)受試物的前處理；

(2)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的制備；

(3)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算；

(4)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞接種；

(5)受試物的分組；

(6)受試物檢測劑量的設定；

(7)受試物培養品的制備；

(8)受試物的孵育；

(9)受試物孵育品的收集；

(10)受試物孵育品的裂解離心；

(11)標準品的配制；

(12)受試物樣品的測定；

(13)丙二醛含量計算。

本發明優選的實施方案中，上述的方法，包括以下具體步驟：

(1)受試物的前處理：吸取一定量的電子煙原液，按照電子煙原液與無血清細胞培養基的體積比為10～90％的比例進行混合稀釋后，放置24h-48h，無菌過濾器過濾除菌，得到待測液，-80℃保存待用；

(2)人肺成纖維細胞HPF單細胞懸浮液的制備：人肺成纖維細胞復蘇后，接種到細胞培養瓶中，置于37℃、5vt％CO₂培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養瓶中的培養基，用磷酸緩沖液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維成纖維細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；

(3)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數板計數法對步驟(2)得到人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的活細胞數；

(4)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數后的人肺成纖維細胞單細胞懸浮液加入成纖維細胞培養基稀釋至2.0×10⁵個/mL，接種到100mm細胞培養皿中，每皿6mL，將細胞培養皿置于37℃、5％vtCO₂培養箱內培養24h；

(5)受試物的分組：將受試物分為兩組：細胞對照組和檢測樣品組；各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞；檢測樣品組為在成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞并添加受試物；

(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子煙原液分為5個非零劑量：25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL；