[發明專利]一種用于檢測電子煙制品對細胞脂質過氧化影響的方法

在審

• 申請號: 201710226543.9
• 申請日: 2017-04-09
• 公開（公告）號: CN107460227A
• 公開（公告）日: 2017-12-12
• 發明（設計）人: 管瑩;夭建華;李雪梅;熊國行;米其利;高茜;朱洲海
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 北京權泰知識產權代理事務所(普通合伙)11460
• 代理人: 任永利

1.一種用于檢測電子煙制品對細胞脂質過氧化影響的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)受試物的前處理；

(2)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的制備；

(3)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算；

(4)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞接種；

(5)受試物的分組；

(6)受試物檢測劑量的設定；

(7)受試物培養品的制備；

(8)受試物的孵育；

(9)受試物孵育品的收集；

(10)受試物孵育品的裂解離心；

(11)標準品的配制；

(12)受試物樣品的測定；

(13)丙二醛含量計算。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下具體步驟：

(1)受試物的前處理：吸取一定量的電子煙原液，按照電子煙原液與無血清細胞培養基的體積比為10～90％的比例進行混合稀釋后，放置24h-48h，無菌過濾器過濾除菌，得到待測液，-80℃保存待用；

(2)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的制備：人肺成纖維細胞復蘇后，接種到細胞培養瓶中，置于37℃、5vt％CO₂培養箱中培養，倒置顯微鏡觀察培養細胞的匯合和形態情況，待細胞長至90％的匯合率時，移除培養瓶中的培養基，用磷酸緩沖液洗兩次，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維成纖維細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；

(3)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度的計算：用血球計數板計數法對步驟(2)得到人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的活細胞數；

(4)人肺成纖維細胞單細胞懸浮液的細胞接種：將步驟(3)計數后的人肺成纖維細胞單細胞懸浮液加入成纖維細胞培養基稀釋至2.0×10⁵個/mL，接種到100mm細胞培養皿中，每皿6mL，將細胞培養皿置于37℃、5％vtCO₂培養箱內培養24h；

(5)受試物的分組：將受試物分為兩組：細胞對照組和檢測樣品組；各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞；檢測樣品組為在成纖維細胞生長培養基上種植人肺成纖維細胞并添加受試物；

(6)受試物檢測劑量的設定：將受試物，即電子煙原液分為5個非零劑量：25mg/mL、50mg/mL、100mg/mL、150mg/mL、200mg/mL；

(7)受試物培養品的制備：移除步驟(4)中100mm細胞培養板內的成纖維細胞培養基，再按步驟(5)進行分組，各組的構成為：細胞對照組為成纖維細胞培養基+人肺成纖維細胞；檢測樣品組為成纖維細胞培養基+人肺成纖維細胞+受試物，并使檢測樣品組的最終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；并且2組培養品用成纖維細胞培養基將每孔中的液體體積補足到6mL；

(8)受試物的孵育：將步驟(7)加樣后的100mm細胞培養板置于37℃、5vt％CO₂培養箱中孵育24h；

(9)受試物孵育品的收集：去除步驟(8)中的培養基，用磷酸鹽緩沖液PBA洗一遍，加入適量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸鹽緩沖液的濃度單位為質量：體積；單層孵育約1-2min，用成纖維細胞培養液懸起，1000rpm低溫離心10min；

(10)受試物孵育品的裂解離心：收集(9)步驟得到的細胞，加入100μL細胞裂解液，裂解后收集細胞，1600rpm低溫離心10min，取上清液待后續測定；

(11)標準品的配制：取適量丙二醛標準品用蒸餾水稀釋至1、2、5、10、20、50μM，用于制作標準曲線；

(12)受試物樣品的測定：在不同離心管內加入0.1mL步驟(10)制備的樣品待測液、不同濃度梯度的標準品稀釋液，隨后分別加入0.2mL濃度為0.185mg/mL的硫代巴比妥酸、丙二醛檢測工作液混勻后100℃沸水浴15min，1000g室溫離心10min，取200μL上清液加入96孔板中，酶標儀532nm測定吸光度；

(13)丙二醛含量計算：根據標準溶液吸光度值繪制標準曲線，計算丙二醛含量。