[發(fā)明專利]一種提高頭孢菌素C酰化酶活性的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710225603.5
• 申請日: 2017-04-07
• 公開（公告）號: CN108690849A
• 公開（公告）日: 2018-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余少文;蒙秋平;謝寧;胡萍;潘慶;湯新
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N9/80;C12R1/19
• 代理公司: 深圳市德錦知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44352
• 代理人: 黃萍

本發(fā)明提供了一種提高頭孢菌素C酰化酶活性的方法及其應(yīng)用，所述方法包括制備卡那霉素抗性基因和ptsG基因雙缺陷型的大腸桿菌菌株；將攜帶頭孢菌素C酰化酶基因的表達載體轉(zhuǎn)化所述大腸桿菌菌株，獲得轉(zhuǎn)化子；培養(yǎng)并誘導(dǎo)所述轉(zhuǎn)化子表達頭孢菌素C酰化酶。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高頭孢菌素C酰化酶活性的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)是工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)抗生素過程中的重要中間體，利用它可以轉(zhuǎn)化合成目前使用的多種常見的頭孢類藥物。7-ACA的生產(chǎn)有兩類：化學(xué)法和酶轉(zhuǎn)化法。化學(xué)法的合成過程復(fù)雜，對環(huán)境有污染，目前相關(guān)研究更多的是酶轉(zhuǎn)化法。酶轉(zhuǎn)化法又分兩步酶法和一步酶法。兩步酶法相對一步酶法易于實現(xiàn)，但多了一個步驟，產(chǎn)物回收處理等增加了生產(chǎn)成本，故而相對高效的一步酶法更受研究人員青睞，然而，一步酶法中使用的頭孢菌素C酰化酶(CPCAcy)，酶活一直難以提高，從而限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

頭孢菌素C酰化酶是能將頭孢菌素C(CPC)轉(zhuǎn)化為7-氨基頭孢烷酸(7-ACA)的水解酶，適宜的反應(yīng)pH為8.0左右。在菌體發(fā)酵培養(yǎng)過程中，使用磷酸鹽緩沖液可以將發(fā)酵液穩(wěn)定在pH8.0左右，CPCAcy活性有明顯提升。培養(yǎng)基優(yōu)化時發(fā)現(xiàn)，在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加甘油和葡萄糖，均有助于出發(fā)菌株CPCAcy酶活的提高，且添加甘油對CPCAcy酶活的影響更加明顯。大腸桿菌利用葡萄糖進行代謝，產(chǎn)生酸性產(chǎn)物乙酸，酸性的環(huán)境會對CPCAcy酶活有影響。P1噬菌體可將供體菌DNA轉(zhuǎn)移到受體菌，使受體菌的基因型與表現(xiàn)型發(fā)生改變，這個過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。P1噬菌體在復(fù)制時，頭部包裝易發(fā)生錯誤，可將供體菌基因組的部分DNA片段誤包入頭部蛋白質(zhì)衣殼中。這些供體菌的DNA片段隨P1噬菌體進入受體菌，替換受體菌中部分染色體組DNA并可永久保留在受體菌基因組中。P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率一般很低，需要使用選擇性標(biāo)記進行轉(zhuǎn)導(dǎo)子篩選，本發(fā)明使用的選擇性標(biāo)記為卡那霉素抗性基因(KnR)。本發(fā)明通過P1噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得敲除了ptsG基因的BL21(DE3)菌株，再使用帶有氨芐青霉素抗性的溫度敏感型pCP20質(zhì)粒將標(biāo)記基因(KnR)敲除，得到無抗性、無ptsG基因的BL21(DE3)菌株。并將表達載體pET-28a-CPCAcy、pACYCDuet-1-CPCAcy、pETDuet-1-CPCAcy和pRSFDuet-1-CPCAcy通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)入到無抗性、無ptsG基因的BL21(DE3)菌株的菌株中。結(jié)果表明敲除ptsG基因的菌株，對頭孢菌素C酰化酶活性具有有益的影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供了一種提高頭孢菌素C酰化酶活性的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)制備卡那霉素抗性基因和ptsG基因雙缺陷型的大腸桿菌菌株；

(2)將攜帶頭孢菌素C酰化酶基因的表達載體轉(zhuǎn)化所述大腸桿菌菌株，獲得轉(zhuǎn)化子；

(3)培養(yǎng)并誘導(dǎo)所述轉(zhuǎn)化子表達頭孢菌素C酰化酶。

進一步地，上述方法中所述大腸桿菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

進一步地，上述方法中所述的表達載體為pET-28a-CPCAcy、pACYCDuet-1-CPCAcy、pETDuet-1-CPCAcy和pRSFDuet-1-CPCAcy，它們的結(jié)構(gòu)圖分別如圖1-4所示。其中，本發(fā)明優(yōu)選pACYCDuet-1-CPCAcy表達載體。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種培養(yǎng)本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括以下配方：1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，0.3％甘油，PH為8.0。

本發(fā)明的又一個目的是提供本發(fā)明所述方法在提高頭孢菌素C酰化酶活性中的應(yīng)用。