[發(fā)明專利]一種草莓成花促進基因FaLFY5、表達載體、構(gòu)建方法及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710219922.5
• 申請日: 2017-04-06
• 公開（公告）號: CN106929517A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉月學;鄒冬梅;張志宏;馬躍;張麗杰;李賀
• 申請（專利權(quán)）人: 沈陽農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12N15/10;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 西安銘澤知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙)61223
• 代理人: 潘宏偉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種草莓成花促進基因FaLFY5、表達載體、構(gòu)建方法及應用。

背景技術(shù)

成花是高等植物生長發(fā)育過程中的重要環(huán)節(jié)，成花代表了生殖生長的啟動，能否適時成花對以收獲花、果器官作為商品的農(nóng)作物生產(chǎn)來講意義重大；因此，植物成花機理方面的有關(guān)研究是生命科學領(lǐng)域研究的熱點問題。

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)是薔薇科草莓屬植物，果實柔軟多汁，營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟價值較高，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培，目前中國的草莓栽培面積和產(chǎn)量均居世界第一。我國草莓生產(chǎn)中促成和半促成栽培方式約占八成，在草莓設(shè)施栽培生產(chǎn)過程中，常存在因管理措施不到位而造成植株不能適時、正常花芽分化，從而影響其產(chǎn)量、產(chǎn)期和質(zhì)量的現(xiàn)象；如何促進植株進行高質(zhì)量的花芽分化是使其提早上市并提高產(chǎn)量和質(zhì)量，以最終增加經(jīng)濟效益的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。

LFY及其同源基因編碼轉(zhuǎn)錄因子的激活蛋白，是花形成的最早標記基因之一，它的表達是花形成的充分且必要條件，起基因開關(guān)的作用，在從營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)入生殖生長的轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮重要作用，并且正向調(diào)節(jié)隨后的花器官特征基因如AP1等的啟動。因此，開發(fā)新的LFY類基因?qū)τ谘芯坎葺戎参锘ㄐ伟l(fā)育具有良好的應用前景。

我們在草莓的花芽分化研究中分離獲得了草莓中的一個新LFY類基因FaLFY5，目前未見其序列信息、載體構(gòu)建及其基因功能報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種草莓成花促進基因FaLFY5、表達載體、構(gòu)建方法及應用，提供一個新的草莓成花促進基因FaLFY5，促進植物提早成花、完善植物成花通路調(diào)控途徑中具有良好的應用前景。

本發(fā)明提供了一種草莓成花促進基因FaLFY5，所述草莓成花促進基因FaLFY5的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了一種含有所述的草莓成花促進基因FaLFY5的表達載體，所述表達載體是將如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列插入植物表達載體pCAMBIA1304中得到的。

本發(fā)明還提供了上述草莓成花促進基因FaLFY5的克隆方法，具體包括以下步驟：

步驟1，提取草莓花芽總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈；

步驟2，設(shè)計擴增引物，所述擴增引物為：

上游引物F1：5'-ATGGATCCAAACGCGTTCACT-3'

下游引物R1：5'-TCAGTAGGGAAGCGGATCAGT-3'；

然后以反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增，得到草莓成花促進基因FaLFY5，并將草莓成花促進基因FaLFY5連接到pGM-T載體保存。

本發(fā)明還提供了上述表達載體的構(gòu)建方法，具體包括以下步驟：

S1，提取草莓花芽總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA鏈

S2，根據(jù)植物表達載體pCAMBIA1304的多克隆微點序列特點，設(shè)計一對引入NcoⅠ和Bgl II酶切位點的引物序列，所述引物序列為：

上游引物F2：5'-CATGCCATGGATGGATCCAAACGCGTTCACT-3'

下游引物R2：5'-GAAGATCTTCAGTAGGGAAGCGGATCAGT-3'；

再以步驟S1中的cDNA鏈為模板，進行PCR擴增，得到的擴增產(chǎn)物連接到pGM-T載體，得到重組質(zhì)粒pGM-T-FaLFY5；

S3，利用NcoⅠ和Bgl II雙酶切重組質(zhì)粒pGM-T-FaLFY5，回收長序列片段的pGM-T-FaLFY5酶切產(chǎn)物；和利用NcoⅠ和Bgl II雙酶切植物表達載體pCAMBIA1304，回收長序列片段的pCAMBIA1304酶切產(chǎn)物；

S4，將pGM-T-FaLFY5酶切產(chǎn)物和pCAMBIA1304酶切產(chǎn)物經(jīng)T4DNA連接酶連接，得到表達載體，并將所述表達載體命名為植物表達載體pCAMBIA1304-FaLFY5。

本發(fā)明還提供了一種上述草莓成花促進基因FaLFY5在促進植物提早成花的分子育種中的應用。

本發(fā)明還提供了一種上述表達載體在促進植物提早成花的分子育種中的應用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的一種草莓成花促進基因FaLFY5、表達載體、構(gòu)建方法及應用，具有以下有益效果：

1、本發(fā)明通過草莓成花促進基因FaLFY5的表達載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化，證明其草莓成花促進基因FaLFY5在植物成花過程中起正向促進調(diào)控作用，為深入揭示草莓成花分子調(diào)控機制和通過基因工程手段獲得早成花草莓品種奠定了基礎(chǔ)。