[發明專利]誘導臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法

有效

• 申請號: 201710218934.6
• 申請日: 2017-04-05
• 公開（公告）號: CN106834223B
• 公開（公告）日: 2020-03-27
• 發明（設計）人: 顏學恒;薛宜青;熊延獅;張智培;蘇恩筠
• 申請（專利權）人: 上海逍鵬生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 上海遠同律師事務所 31307
• 代理人: 張堅

本發明涉及一種誘導臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，該方法包括接種、懸滴培養以及加入分化培養基懸滴培養三個步驟，一方面利用了三維培養和控制細胞數量和密度的方式實現間充質干細胞的定性定量分化，可以在較短時間內獲得品質受到管控的軟骨細胞團，另一方面本發明采用了懸滴培養方式，無需貼壁，不需要使用血清，更不需要震蕩培養或者額外的載體，可以大大降低細胞的損傷和污染。

技術領域

本發明屬于細胞生物技術及骨組織工程技術領域，具體涉及一種誘導臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法。

背景技術

干細胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞類型，它是人體新生細胞從增殖、遷移、分化直至達到成熟這一系列過程中的第一個細胞。關于干細胞的研究已成為目前生物學上最具挑戰性、也最具有吸引力的領域之一。

間充質干細胞(MSCs，mesenehymal stem cells)，最早在骨髓中被發現，是一種來源于中胚層的多能干細胞。作為一類具有自我更新能力的成體干細胞，間充質干細胞具有多向分化潛能、造血支持、免疫調控、可連續培養和自我更新等特點，現已受到越來越多的關注。間充質干細胞在體內或體外一定條件下可以向多種細胞組織類型分化。它不僅可以向多種間質來源的細胞譜系分化，例如脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、肌鍵細胞等等，也可以向其他的細胞譜系分化，比如星形膠質細胞、肌原細胞、心肌細胞以及神經細胞等。由于體外分離培養的MSCs在細胞表型上沒有明顯的改變，也無功能缺失，因此被認為是理想的修復和抗衰老細胞來源。

目前已知間充質干細胞可從骨髓、脂肪組織、華頓氏膠質、臍帶、軟骨組織和齒齦分離出來，其中自臍帶可以獲得更多的干細胞，且臍帶取得容易，無需侵入性的醫療程序。此外自臍帶分離的干細胞，表面所攜抗原少且具有抑制免疫反應的特性，對于克服異體排斥反應，有更顯著的效果，因此極具推廣應用的價值。

軟骨為一種半透明的彈性組織，在人體內起到支持與保護的作用。由于軟骨本身自我修復能力非常弱，一旦受到損壞，往往自行無法恢復，從而讓軟骨損傷成為骨科臨床治療上的難題之一。傳統治療是采用骨軟骨柱移植的方法，然而可供移植的骨軟骨來源有限，再者很難確保各個骨軟骨柱愈合完整，還存在軟骨脫落的風險。后來，科學家們發現間充質干細胞可誘導分化成軟骨細胞，從而開發出取代傳統的自體軟骨細胞移植的干細胞治療方法。

關于間充質干細胞在體外誘導分化成軟骨細胞的過程，其中，關于種子細胞在三維空間形成團聚是一個關鍵因素；三維空間細胞團的大小和分布會影響細胞因子的分泌和傳遞致使體外軟骨細胞分化缺乏良好的質量控管。

本領域亟待開發一種誘導臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法。

發明內容

鑒于相關技術的上述問題和/或其他問題，本發明一種誘導臍帶間充質干細胞向軟骨細胞分化的方法，該方法包括以下步驟：步驟1)接種：經分散成單個細胞的臍帶來源的間充質干細胞懸浮于DMEM高糖培養基中形成細胞溶液，再將所述細胞溶液以250個/μL～2500個/μL的細胞濃度，滴在培養板上；步驟2)懸滴培養：將所述培養板倒置進行懸滴培養48h，獲得成簇種子細胞團；步驟3)加入分化培養基進行懸滴培養：吸除所述培養板上的DMEM高糖培養基，加入軟骨分化培養基，繼續倒置所述培養板進行懸滴培養獲得軟骨細胞團。

優選的，步驟1)中，所述培養板為96孔板，將所述細胞溶液以100μL的體積滴在所述96孔板中。

優選的，所述步驟2)中懸滴培養的條件為37℃，5％CO₂以及飽和濕度。

優選的，所述步驟3)中加入分化培養基后懸滴培養的條件為37℃，5％CO₂以及飽和濕度；每2天更換分化培養基，培養總時長為15天。

優選的，步驟3)中所采用的軟骨分化培養基為無血清的軟骨分化培養基。