[發明專利]基于模擬酶標記銀納米粒子的高靈敏化學發光免疫分析方法

在審

• 申請號: 201710216740.2
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN106970231A
• 公開（公告）日: 2017-07-21
• 發明（設計）人: 李萍;宗晨;張多多
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/543;G01N21/76
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一、技術領域

本發明為一種基于模擬酶標記銀納米粒子的高靈敏化學發光免疫分析方法，通過構建可拋式免疫傳感芯片，設計新型DNA模擬酶標記銀納米粒子探針，實現化學發光信號放大，用于蛋白質的高靈敏高通量成像免疫分析。

二、背景技術

蛋白質標志物的檢測在心血管疾病的臨床診斷和監測中發揮著重要作用。免疫分析因其對生物分子高特異識別能力，在蛋白質標志物的檢測中得到了廣泛應用。作為最普及的免疫分析方法，酶聯免疫分析需要專業人員操作，儀器復雜，步驟繁冗，耗時昂貴，這些缺點大大限制了它的進一步應用。

發展簡單易操作、成本低、高通量的免疫分析方法，是蛋白質檢測一直以來所追求的目標。在單個分析流程中同時或者類同時實現多個樣品的檢測，具有分析通量高、所需時間短、樣品消耗少等突出優點，因此基于可拋式免疫傳感芯片的免疫分析方法近年來得到了越來越多的關注。然而，常見的蛋白質陣列芯片多采用光刻技術、點陣技術或印刷技術制備而成，步驟非常復雜，而且需要配備相應機器，非專業人士很難完成。

此外在實際應用領域中，免疫分析對高靈敏方法的需求也與日俱增，為了實現對低豐度組分的準確檢測，大多數免疫檢測方法都選擇將天然酶如辣根過氧化酶、堿性磷酸酶負載到納米粒子上實現信號放大，但天然酶常常因為微小的構象變化就影響它們的催化活性從而導致變質，而用于負載酶的納米粒子如金納米粒子、碳納米管、石墨烯等，無論合成或生物修飾都條件苛刻、價格昂貴。

三、發明內容

本發明的目的是：用最簡單的手工貼膜技術，構建可拋式免疫傳感芯片，使非專業人士也能輕松開展高通量檢測，同時設計一種DNA模擬酶標記的銀納米粒子探針，進行化學發光信號放大，兩者結合，提出一種新型高通量高靈敏化學發光成像免疫分析方法。

本發明提出的高靈敏化學發光成像免疫分析方法如圖1所示，由可拋式免疫傳感芯片(1)、模擬酶標記銀納米粒子探針(2)和信號產生體系(3)構成，通過以下技術方案來制備：

1)可拋式多組分免疫傳感陣列是通過手工貼膜技術，在醛基基片上獲得4×12陣列，在每個傳感池內包被一定量的捕捉抗體Ab1，抗體的氨基與醛基陣列上的芳香醛基共價結合，反應結束后沖洗，再滴加封閉液，封閉結束后沖洗，晾干，制得可捕捉目標抗原的陣列芯片(圖2)；

2)模擬酶標記銀納米粒子探針是在銀納米粒子表面同時修飾信號抗體Ab2和高比例G-四鏈體DNA而制成，后者結合血紅素形成模擬酶，如圖3所示；

3)信號產生體系是利用模擬酶的過氧化物酶特性催化化學發光底物過氧化氫氧化魯米諾的反應，產生強化學發光信號。

免疫分析方法的工作原理：

1)在可拋式免疫傳感芯片的每個傳感池表面滴加標準溶液或待檢測樣品，進行溫育；

2)沖洗后，在每個傳感池表面滴加模擬酶標記銀納米粒子探針，反應結束后沖洗；

3)在每個傳感池表面滴加化學發光底物，通過電感耦合裝置CCD相機進行化學發光成像檢測；

4)每個傳感池的化學發光信號與其所對應標準溶液的濃度成正相關，可據此獲得工作曲線，求出待檢測樣品中目標蛋白質(抗原)的濃度，實現多個樣品中蛋白質的同時高靈敏成像免疫分析。

上述的分析方法，封閉液為含5％牛血清白蛋白(BSA)的0.01M磷酸鹽緩沖液，pH7.4；沖洗液為含0.05％吐溫-20的0.01M磷酸鹽緩沖液，pH 7.4。

本發明與現有技術相比，具有以下特點：

本發明設計了模擬酶標記的銀納米粒子探針進行化學發光信號放大，通過可拋式免疫傳感芯片，提出了一種高靈敏高通量化學發光成像免疫傳感方法。相對于現有檢測系統，具有以下特點：

(1)可拋式免疫傳感芯片是以醛基基片為基底，手工貼膜、化學包被獲得，制備簡單、快速，成本低廉。利用空間分辨模式，48個陣列傳感池可同時進行48個樣品的免疫分析，具有通量高、穩定性和重現性好的優點。

(2)設計的納米探針以銀納米粒子為負載物，原材料易獲得、價廉，制備方法簡單、條件溫和，生物修飾過程易操作，保存穩定性好。

(3)設計新穎的表面負載有大量模擬酶的納米探針，結合模擬酶對過氧化氫魯米諾反應的催化作用，進行信號放大，提高檢測靈敏度，使其更適于低豐度蛋白質的檢測。

(4)該分析方法無需外加光源，設備和操作都非常簡單。

四、附圖說明

圖1.高靈敏化學發光成像免疫分析示意圖

圖2.免疫傳感芯片的制備及夾心免疫反應、信標結合反應及化學發光信號產生示意圖