[發(fā)明專利]一種維生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710216726.2
• 申請(qǐng)日: 2017-04-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106916804A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-07-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 閆磊;桂金秋;孫凱;梁軍;王妍;蔡克瑞;劉春玲;齊悅;晁岳剛;孫曉冬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 牡丹江醫(yī)學(xué)院
• 主分類(lèi)號(hào): C12N11/14
• 分類(lèi)號(hào): C12N11/14;C12P7/62
• 代理公司: 安徽信拓律師事務(wù)所34117
• 代理人: 婁爾玉

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及生物酶催化劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種維生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制備方法。

背景技術(shù)：

維生素A脂肪酸酯是人體正常代謝所不可缺少的一種物質(zhì)，它能維持和促進(jìn)人體生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖和細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，對(duì)視覺(jué)的形成有明顯的作用。而且，維生素A脂肪酸酯還有助于細(xì)胞的繁殖和區(qū)分壞死細(xì)胞，并且作為一種抗氧化劑能與那些可以產(chǎn)生基因突變的自由基結(jié)合。

目前，常采用化學(xué)法生產(chǎn)維生素A脂肪酸酯，使用催化劑甲醇鈉、Grignard試劑等并在高溫高壓條件下進(jìn)行催化反應(yīng)。雖然收率不錯(cuò)，但存在許多難以克服的缺點(diǎn)，如催化劑有毒性、高溫高壓反應(yīng)能耗高、副反應(yīng)多、分離和精制困難等。因此，近年來(lái)人們開(kāi)始利用酶催化法制備維生素A脂肪酸酯。

專利CN 1621528A公開(kāi)了一種用固定化脂肪酶催化合成維生素A脂肪酸酯的方法，其說(shuō)明書(shū)實(shí)施例中報(bào)道的原料轉(zhuǎn)化率最高為85％，最低為51％，由于未公開(kāi)維生素A脂肪酸酯的收率，而原料在反應(yīng)過(guò)程中會(huì)生成副產(chǎn)物，因此維生素A脂肪酸酯收率遠(yuǎn)低于85％。而在此反應(yīng)中固定化脂肪酶的催化活性十分關(guān)鍵，直接決定原料的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物收率，因此目前仍需致力于開(kāi)發(fā)高活性且易回收再利用的固定化脂肪酶。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種催化活性強(qiáng)、收率高且綠色環(huán)保的維生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制備方法。

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題采用以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種維生素A脂肪酸酯合成用固定化脂肪酶的制備方法，包括如下步驟：

(1)共固定劑的制備：向泊洛沙姆中加入交聯(lián)聚維酮和六羥甲基三聚氰胺六甲醚，并以5℃/min的升溫速度升溫至70-75℃保溫混合15min，然后加入陰離子聚丙烯酰胺和環(huán)氧大豆油，繼續(xù)以5℃/min的升溫速度升溫至115-120℃保溫混合30min，所得混合物轉(zhuǎn)入5-10℃環(huán)境中密封靜置1h，并再次以5℃/min的升溫速度升溫至110-115℃保溫混合30min，再加入50-55℃水，充分混合后于50-55℃保溫靜置1h，過(guò)濾，所得濾渣送入冷凍干燥機(jī)中，干燥后所得固體經(jīng)超微粉碎機(jī)制成微粉，即得共固定劑；

(2)載體的制備：向水中加入陶瓷微粉、羥丙基甲基纖維素和葡萄糖酸鈉，以5℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合15min，過(guò)濾，所得濾渣水洗三次，并將濾渣加入滾筒式混合機(jī)中；同時(shí)將納米二氧化鈦和納米膠粉加入乙醇中，以5℃/min的升溫速度升溫至回流狀態(tài)保溫混合30min，所得混合液以噴霧方式均勻噴向?yàn)V渣表面，然后自然冷卻至室溫，所得固體于40-45℃下真空干燥，最后于400-450℃下焙燒2h，即得載體；

(3)活化載體的制備：將上述所制載體和共固定劑于45-50℃下充分混合，靜置30min后加入水解聚馬來(lái)酸酐，混合均勻，即得活化載體；

(4)固定化脂肪酶的制備：將酵母類(lèi)脂肪酶的水溶液按5000單位/克活化載體的比例與活化載體混合，于35℃下振蕩24h，振蕩過(guò)程中分3-5次加入過(guò)氧化氫脲，最后離心，經(jīng)室溫晾干后即得固定化脂肪酶。

所述步驟(1)中泊洛沙姆、交聯(lián)聚維酮、六羥甲基三聚氰胺六甲醚、陰離子聚丙烯酰胺、環(huán)氧大豆油和水的質(zhì)量比為15-20:5-10:0.5-1:3-5:0.5-1:50-100。

所述步驟(2)中水、陶瓷微粉、羥丙基甲基纖維素、葡萄糖酸鈉、納米二氧化鈦、納米膠粉和乙醇的質(zhì)量比為50-100:20-25:3-5:0.5-1:5-10:0.5-1:30-40。

所述步驟(3)中載體、共固定劑和水解聚馬來(lái)酸酐的質(zhì)量比為1:1:0.05。

所述步驟(4)中酵母類(lèi)脂肪酶的水溶液按10000單位/克過(guò)氧化氫脲的比例加入過(guò)氧化氫脲。

所述步驟(1)中泊洛沙姆使用前經(jīng)過(guò)預(yù)處理，其具體預(yù)處理方法為：向泊洛沙姆中加入乳酸和田菁粉，充分混合后于微波頻率2450MHz、輸出功率700W下微波處理5min，室溫靜置30min后再次微波處理5min，再加入30-35℃水，攪拌30min后送入噴霧干燥機(jī)中，干燥所得顆粒經(jīng)超微粉碎機(jī)制成微粉。

所述泊洛沙姆、乳酸、田菁粉和水的質(zhì)量比為15-20:0.5-1:0.1-0.2:50-100。