[發明專利]一種高效篩選魏斯氏菌的標記物及其應用

在審

• 申請號: 201710216629.3
• 申請日: 2017-04-05
• 公開（公告）號: CN106906296A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 方芳;李巧玉;徐潔;堵國成;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司23211
• 代理人: 張勇

技術領域

本發明涉及一種高效篩選魏斯氏菌的標記物及其應用，屬于微生物發酵技術領域。

背景技術

魏斯氏菌是革蘭氏陽性菌，屬兼性厭氧、在有氧條件下生長迅速。不具備細胞色素、過氧化氫酶陰性。可通過磷酸戊糖和磷酸轉酮酶途徑異型發酵葡萄糖產D-和/或L-乳酸所，異型發酵葡萄糖還產CO₂、乙醇和(或)乙酸。魏斯氏菌在15℃能生長，一般最適生長溫度在30-37℃，有些菌株在42～45℃能生長。大部分魏斯氏菌來源于營養豐富的食品，食品來源的魏斯氏菌發酵產乳酸、乙酸、乙醇可增加發酵食品的風味及營養，其中產細菌素的W.cibaria應用于食物，可起到防腐的作用；W.confusa合成葡聚糖、果聚糖，能有效地促進體內有益菌生長，抑制腐敗菌生長；泡菜中W.koreensis菌株通過合成纖維素，具有抗肥胖效果。

目前分離鑒定魏斯氏菌的技術有通過菌落形態特征觀察、革蘭氏染色鏡鑒、接觸酶試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、明膠液化試驗、吲哚試驗、淀粉水解試驗等生理生化試驗對菌株進行分離鑒定；通過糖發酵試驗、菌株在4％NaCl、6.5％NaCl下是否生長，菌株在溫度為10、40、45℃下是否生長的試驗，初步進行魏斯氏菌種間鑒定。但是篩選周期通常需要一周左右，且需測定的參數多、步驟繁瑣、工作量大。利用生理生化指標分離篩選鑒定魏斯氏菌，準確性不高，需進一步的擴增菌株的16S rDNA序列進行驗證。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種魏斯氏菌的標記物，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本發明的第二個目的是提供一種篩選魏斯氏菌的方法，根據SEQ ID NO.1所示序列設計引物，對待篩選的微生物進行菌落PCR，再將PCR產物進行凝膠核酸電泳分析和/或測序驗證，擴增獲得與SEQ ID NO,1所示序列存在≥75bp連續相同的核苷酸序列的菌株，或能夠擴增出片段大小為120～180bp的菌株即為魏斯氏屬的菌株。

在本發明的一種實施方式中，所述引物序列包括(1)～(5)任一對，其中，

(1)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA；

(2)上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC；

(3)上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG；

(4)上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC；

(5)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA。

在本發明的一種實施方式中，所述PCR是按照以下程序進行的：94℃30s，94℃3min，55℃30s，72℃1min，72℃10min，12℃保持，循環數32。

在本發明的一種實施方式中，采用上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA擴增獲得片段大小為120～180bp的菌株即為魏斯氏屬(Weissella)的微生物。

在本發明的一種實施方式中，采用上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC擴增獲得片段大小為120～180bp的菌株即為融合魏斯氏菌(Weissella confusa)。

在本發明的一種實施方式中，采用上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG擴增獲得片段大小為120～180bp的菌株即為竇氏魏斯氏菌(Weissella cibaria)。

在本發明的一種實施方式中，采用上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC擴增獲得片段大小為120～180bp的菌株即為綠色魏斯氏菌(Weissella viridescens)。

在本發明的一種實施方式中，采用上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA擴增獲得片段大小為120～180bp的菌株即為類腸膜魏斯氏菌(Weissella paramesenteroides)。