[發明專利]一種高效篩選魏斯氏菌的標記物及其應用

在審

• 申請號: 201710216629.3
• 申請日: 2017-04-05
• 公開（公告）號: CN106906296A
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 方芳;李巧玉;徐潔;堵國成;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司23211
• 代理人: 張勇

1.一種篩選魏斯氏菌的方法，其特征在于，根據SEQ ID NO.1所示序列設計引物，對待篩選的微生物進行菌落PCR，再將PCR產物進行凝膠核酸電泳分析和/或測序驗證，擴增獲得與SEQ ID NO,1所示序列存在≥75bp連續相同核苷酸的菌株即為魏斯氏屬的菌株。

2.一種篩選魏斯氏菌的方法，其特征在于，根據SEQ ID NO.1所示序列設計引物，對待篩選的微生物進行菌落PCR，再將PCR產物進行凝膠核酸電泳分析，成功擴增出片段大小為120～180bp的菌株即為魏斯氏屬的菌株。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述引物序列包括(1)～(5)中任一對，其中：

(1)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGACA，下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA；

(2)上游引物：GGCGGATTGGTCTCTTTTTG，下游引物：CACGCTCAGTAACCGTGTGC；

(3)上游引物：GCATCCGTCAGTTCATCAC；下游引物：GATTACGCACTTACCACAGG；

(4)上游引物：CGCAAACACAACAAGCCTAT；下游引物：TGTTGAGCAAGTTCCAAAGC；

(5)上游引物：GCTCTGAAGTGATTTTATCTGAC；下游引物：AACCATGCGGTTGTTGGTA。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，將待分離的混合菌在含萬古霉素的選擇性培養基上培養，獲得單菌落進行菌落PCR；所述選擇性培養基含有：蛋白胨8.0～12.0g/L、牛肉粉4.0～6.0g/L、酵母粉3.0～5.0g/L、葡萄糖20.0～30.0g/L、吐溫801.0～2.0mL/L、磷酸氫二鉀2.0～3.0g/L、乙酸鈉4.0～6.0g/L、檸檬酸三銨2.0～3.0g/L、硫酸鎂0.2～0.5g/L、硫酸錳0.05～0.1g/L，L-半胱氨酸0.5～1g/L，那他霉素1.0～1.5g/L，萬古霉素2.0～3.0g/L，初始pH為7.0～7.2。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述魏斯氏菌是魏斯氏屬的菌株，包括類腸膜魏斯氏菌、融合魏斯氏菌、竇氏魏斯氏菌、綠色魏斯氏菌、微小魏斯氏菌、赫倫魏斯氏菌、坎氏魏斯氏菌、或土壤魏斯氏菌。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，將待分離的樣品接種至選擇性培養基，在30～37℃靜置富集培養12～24h，將上述培養液稀釋涂布至固體的選擇性培養基，30～37℃培養24～36h。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法的具體步驟如下：

1)將待篩選的樣品接種于選擇性培養基，于37℃恒溫培養箱中培養24h得培養液，所述的選擇性培養基的配方如下：蛋白胨10.0g/L、牛肉粉5.0g/L、酵母粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、吐溫801.0mL/L、磷酸氫二鉀2.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、檸檬酸三銨2.0g/L、硫酸鎂0.2g/L、硫酸錳0.05g/L，L-半胱氨酸0.5g/L，那他霉素1.0g/L，萬古霉素20g/L，調節初始pH為7.0；

2)將上述培養液稀釋涂布至固體選擇性培養基，37℃培養36h；所述的固體選擇性培養基是含20g/L瓊脂的步驟(1)所述的選擇性培養基；

3)根據SEQ ID NO.1設計引物，挑取步驟2)獲得的單菌落進行特異性引物菌落PCR，PCR產物用2％濃度的瓊脂糖凝膠電泳成像，能夠得到大小為120～180bp的條帶的菌株為魏斯氏菌。

8.一種魏斯氏菌的標記物，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

9.權利要求8所述的標記物在食品、生物、醫藥領域鑒定菌種方面的應用。

10.權利要求1～7任一所述的方法在高通量篩選方面的應用。