[發明專利]高產手性D-(-)-乙偶姻的谷氨酸棒桿菌菌株及構建及應用

有效

• 申請號: 201710215459.7
• 申請日: 2017-04-03
• 公開（公告）號: CN106868033B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 陳濤;陶然;付晶;毛雨豐;黃燦;王智文;趙學明
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/77
• 分類號: C12N15/77;C12N1/21;C12P7/26;C12R1/15
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 陸藝

本發明公開了高產手性D?(?)?乙偶姻的谷氨酸棒桿菌菌株及構建及應用，構建方法為：(1)在谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032中敲除ldh基因，pta?ack基因操縱子，nagD基因和butA基因；在染色體上的乙酸生成pta?ack位點，插入P_tuf強啟動子過表達的合成支路alsSD操縱子；(2)用載體pEC?XK99E連接合成支路alsSD操縱子得到pEC?XK99E?alsSD質粒，刪除其lacIq區域,得到pEC?XK99E?SD?△lacIq，導入步驟(1)獲得谷氨酸棒桿菌中。本發明菌株安全，用葡萄糖在有氧條件下生產乙偶姻。

技術領域

本發明屬于生物工程技術與應用領域，具體地涉及一種高產手性D-(-)-乙偶姻的谷氨酸棒桿菌菌株及構建及應用。

背景技術

乙偶姻的化學名是3-羥基-2-丁酮，又叫甲基乙酰甲醇。乙偶姻存在于很多食物當中，有奶香氣味，是常用的食品級香料。乙偶姻也是4-C平臺化合物的一種，被美國能源部(Department of Energy)列為30種值得優先開發的平臺化合物之一。乙偶姻有一個手性碳原子，因此有D-(-)-和L-(+)-兩種手性異構體。手性乙偶姻具有較高的產品附加值，能用于醫藥中間體和手性化合物的合成。一直以來，化學合成法是乙偶姻工業化生產的主要方法包括2,3-丁二醇的氧化、丁酮的氯化水解和丁二酮的部分加氫等方法。這些工藝雖然操作較為簡便，但乙偶姻最終的得率偏低，能耗較大且對環境有一定的污染，而且其所制得的乙偶姻多為兩種手性異構體的混合物。

與傳統化學合成法相比，乙偶姻的微生物發酵法對環境友好，工藝簡單，技術上較為成熟，符合綠色化工的要求。但值得注意的是，目前乙偶姻的生物法制備存在以下三點缺陷。首先，目前乙偶姻的高產菌種很多是病原菌，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、以及陰溝腸桿菌溶解亞種(Enterobacter cloacae subsp.dissolvens)等微生物，而大規模工業化生產的安全性原則在很大程度上限制了這些生產菌株的應用，因此迫切需要開發出安全可靠的代謝工程菌株。其次，很多生產乙偶姻的非致病菌種的獲得是通過誘變完成，這對菌株的遺傳穩定性造成了一定的影響，也為后續通過代謝工程手段進一步改造菌株造成了困難。最后，乙偶姻的產量、得率、生產效率并不夠理想，絕大多數乙偶姻高產菌株的產量在60g/L左右。因此，利用代謝工程、輔因子工程、發酵工程和合成生物學方法對模式菌株的代謝途徑進行重新設計和合理改造是一種較好的策略。

野生型的谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)不能天然生產乙偶姻。但是經過代謝工程等手段改造的谷氨酸棒狀桿菌作為乙偶姻的生產菌株具有以下幾點優勢：1.當乙偶姻用于食品級添加劑使用時，需要保證所使用的菌株為安全的非致病性菌株(Class 1microorganisms)，即GRAS(Generally Recognized as Safe)微生物，而谷氨酸棒狀桿菌是一種典型的GRAS菌株，非常適合乙偶姻生物大規模工業化生產，可以有效降低生產環節中用于生防的成本。2.魯棒性強。作為一種革蘭氏陽性菌，其對高濃度底物、纖維素水解液中的有害成分、高濃度鹽、酸、醇等的耐受能力較強。3.作為一種重要的模式菌株，對其生理生化特性及遺傳背景已經有了比較深入的了解，相關的分子生物學方法和基因操作技術都比較成熟，有利于通過代謝工程及合成生物學的合理設計來改進菌種。

經檢索，目前有公開發表的文獻對谷氨酸棒狀桿菌生產乙偶姻的進行了報道，但最終的工程菌株生產乙偶姻的得率、產量、產率等方面也并不理想。

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種高產手性D-(-)-乙偶姻的谷氨酸棒桿菌菌株。

本發明的第二個目的是提供一種高產手性D-(-)-乙偶姻的谷氨酸棒桿菌菌株的構建方法。