[發明專利]細胞分離制片染色一體裝置和循環腫瘤細胞捕獲方法

在審

• 申請號: 201710211262.6
• 申請日: 2017-04-01
• 公開（公告）號: CN106989970A
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 馮澄宇
• 申請（專利權）人: 蘇州汶顥微流控技術股份有限公司
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/34;G01N1/31
• 代理公司: 蘇州謹和知識產權代理事務所(特殊普通合伙)32295
• 代理人: 仲崇明

技術領域

本申請屬于體外診斷和微流控技術領域，特別是涉及一種細胞分離制片染色一體裝置和循環腫瘤細胞捕獲方法。

背景技術

循環腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)是指從原發腫瘤擴散進入外周循環血液系統中的腫瘤細胞，它的出現標志著腫瘤細胞已經開始從病灶組織向四周擴散，從而可能導致更多器官組織產生病變。

循環腫瘤細胞可在腫瘤發生的早期出現，且研究表明約90％的癌癥死亡案例與CTCs擴散有關，因此，CTCs檢測在重大疾病的早期預防、治療效果評估、藥物敏感性測試及腫瘤復發監測等醫學應用方面具有十分重要的意義。

循環腫瘤細胞檢測的最大難題在于其數量極少：通常在臨床上，人們研究的對象是一個非齊性總體，其中包含了大量的細胞信息，而CTCs對人體正常血細胞的比例僅約為1:109，或在1mL血液中僅有1～100個CTCs,因此在檢測前必須對其進行分選富集，以去除血液中的大部分紅細胞和白細胞。

理想的CTCs分選應能達到以下三點要求：首先要能將盡量多的非目標細胞分離出去，其次要在特定的出口收集到盡量多的目標細胞；最后要考慮到CTCs數量稀少導致需要處理的樣本量較大以及細胞活性等因素，要求能在短時間內處理大量的樣品。

傳統的細胞分選多在宏觀尺度下進行，如離心分選、化學溶解、基于熒光或磁珠技術的抗體標記分選等，這些方法雖然成熟可靠，但系統復雜、操作繁瑣、需要樣品量大，在細胞轉移、容器更換及樣品化學處理等環節極易造成目標細胞的損失，難以滿足上述三點分選要求。

目前唯一通過美國食品藥品監督管理局認證的用于血液中CTCs分選、計數的商業化產品，CellSearch采用外面包被了特異性抗體抗EpCAM(上皮細胞粘附因子)的免疫納米磁珠，通過抗原抗體反應，與血液中表達EpCAM的CTCs結合，并進一步通過熒光反應識別CTCs。該計數雖然擁有較高的靈敏度，但存在儀器及消耗的試劑昂貴，并且采用抗體捕獲細胞的局限性大，并不是所有的腫瘤細胞都表達EpCAM，檢測效率較低。

興起于20世紀90年代的微流控技術，通過微米級別的流道精確操控微升、毫升級別的樣品。得益于其特征尺寸與細胞尺寸正好匹配，微流控技術在細胞分選方面優勢巨大。與常規分選方法相比，微流控器件具有消耗樣品量少，有較高的分辨精度及靈敏度、易于集成及微型化等優點，且在微流控器件中可以連續地實現樣品注入-細胞分選-目標細胞識別的整個過程，極大簡化操作，并減少細胞損失。

發明內容

本發明的目的在于提供一種細胞分離制片染色一體裝置和捕獲方法，以克服現有技術中的不足。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

本申請實施例公開一種細胞分離制片染色一體裝置，包括基材以及沿第一方向延伸于基材內的溝道，所述溝通位于第一方向的兩端分別形成有樣品入口和樣品出口，所述溝道內并列設置有n排微柱陣列，n≥2，每排所述微柱陣列沿第二方向延伸，所述第二方向垂直于所述第一方向，每排所述微柱陣列分別包括間隔設置的多個微柱，相鄰所述微柱之間形成有捕捉間隙，并滿足：

(a)、自樣品入口至樣品出口方向，第x排微柱陣列的捕捉間隙＞第x+1排微柱陣列的捕捉間隙，1≤x＜n；

(b)、第n排微柱陣列的捕捉間隙小于循環腫瘤細胞的外徑。

優選的，在上述的細胞分離制片染色一體裝置中，所述基材包括上下疊加設置的聚二甲基硅氧烷和標準載玻片，所述溝通形成于聚二甲基硅氧烷和標準載玻片之間。

相應的，本申請還公開了一種細胞分離制片染色一體裝置的循環腫瘤細胞捕獲方法，包括步驟：

(1)、采用紅細胞裂解液裂解腫瘤病人血樣中的紅細胞，離心吸取上清液，用細胞緩沖液重懸剩余細胞；

(2)、將獲得的細胞懸液從樣品入口通入微流控芯片中，將細胞固定液通入微流控芯片中，完成循環腫瘤細胞的捕獲。

優選的，在上述的循環腫瘤細胞捕獲方法中，步驟(1)中，所述的細胞裂解液為紅細胞裂解液。

優選的，在上述的循環腫瘤細胞捕獲方法中，細胞緩沖液為牛血清白蛋白和tewwn20的磷酸緩沖液。

優選的，在上述的循環腫瘤細胞捕獲方法中，細胞固定液為4％多聚甲醛水溶液。

優選的，在上述的循環腫瘤細胞捕獲方法中，還包括循環腫瘤細胞熒光染色步驟：