[發(fā)明專利]一種特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針及其原位熒光雜交檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710210001.2
• 申請日: 2017-03-31
• 公開（公告）號: CN106987630A
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發(fā)明（設計）人: 李田;許晨;羅堿;徐金智;周澤揚
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京同恒源知識產(chǎn)權代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發(fā)明屬于生物分子檢測領域，涉及一種特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針及其原位熒光雜交檢測方法。

背景技術

家蠶微孢子蟲(Nosema bombycis，N.b)是家蠶微粒子病的病原，不僅能夠水平傳播，而且能夠經(jīng)卵垂直傳播感染后代家蠶，對生產(chǎn)危害巨大，是蠶種生產(chǎn)中的法定檢疫對象。由于N.b營專性細胞內寄生，無法離體培養(yǎng)，且其孢子結構特殊，多數(shù)常規(guī)研究方法不能使用或尚未建立，因此其研究受到諸多技術限制，以致目前對其生活周期、侵染過程、致病機理等重要特征都尚不明確。目前生產(chǎn)上的蠶種檢測主要是顯微鏡檢母蛾和成品卵中具有折光性的N.b的孢子，而對非孢子時期的N.b則無法進行鏡檢檢查。

家蠶微孢子蟲的生活周期大概分為三個階段，即感染期、裂殖增殖期、孢子增殖期。目前常用的家蠶微孢子蟲觀察方法主要有三種：一是利用DAPI、DY96等染料對家蠶微孢子蟲的細胞核進行染色觀察，但此法只能顯示細胞核和幾丁質成分，而不能顯示家蠶微孢子蟲的完整輪廓特征，并且其宿主的細胞核也會被同時標記，對觀察病原有一定的干擾；二是通過制備家蠶微孢子蟲的特異性抗體進行標記觀察，但此法耗時長、成本高、穩(wěn)定性差；三是利用掃描電鏡和透射電鏡技術對不同時期的家蠶微孢子蟲進行直接觀察，但該方法操作繁瑣、制樣難度大、難以長期頻繁使用。因此，研究和生產(chǎn)上需要建立一種更直觀、簡便、特異的方法來檢測家蠶微孢子蟲。

熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是研究中常用的標記觀察技術。利用熒光標記的特異性RNA或DNA探針對細胞內的核酸進行標記，能夠快速簡便的對不同物種不同時期的細胞進行特異性的觀察。此技術的關鍵是設計特異高效的標記探針，并有針對性地建立標記流程。然而，由于家蠶微孢子蟲前期研究基礎薄弱，缺乏充分的分子數(shù)據(jù)，及其結構特殊、無法離體培養(yǎng)的特征，以致尚未發(fā)明出家蠶微孢子蟲的FISH標記方法。

發(fā)明內容

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種能特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針；本發(fā)明的目的之二提供在感染家蠶微孢子蟲的細胞中特異性地標記出家蠶微孢子蟲熒光核酸探針；本發(fā)明的目的之三是提供在感染家蠶微孢子蟲的細胞中特異性地標記出家蠶微孢子蟲的熒光原位雜交方法。

為達到上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

1.一種特異性標記家蠶微孢子蟲的核酸探針，核酸探針序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

2.含有序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的熒光探針，熒光探針由SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2和熒光染料組成，所述熒光染料結合在核酸探針的5’端或3’端。

進一步，所述熒光染料為Cy3、Cy5、FITC、FAM、Alexa Fluor 488或Biotin。

進一步，所述熒光染料為Cy3。

3.利用熒光探針特異性標記家蠶微孢子蟲的熒光原位雜交方法，熒光原位雜交方法為以下步驟：

(1)用多聚甲醛對感染家蠶微孢子蟲的細胞進行固定，所述熒光探針用雜交液進行稀釋至終濃度為3～5ng/μL，于46℃進行雜交，雜交10～12小時，再用雜交清洗液清洗非特異性結合的探針，于48℃清洗1～4小時；

(2)用100ng/μL DAPI對細胞的細胞核以及家蠶微孢子蟲的細胞核進行標記，室溫染色30min，PBS清洗，封片，再用熒光顯微鏡，選取相應的激發(fā)波長觀測熒光探針標記結果。

進一步，所述細胞為家蠶胚胎細胞、家蠶卵巢細胞或草地貪夜蛾細胞。

進一步，所述細胞為家蠶胚胎細胞。

進一步，所述多聚甲醛的質量濃度為4％；雜交液為含有900mM NaCl,20mM Tris,0.01％SDS,PH值為7.5的水溶液；所述雜交清洗液為含有900mM NaCl,20mM Tris，0.01％SDS,5mM EDTA PH值為7.5的水溶液。

進一步，所述PBS清洗是用PBS清洗1～5次，每次5～10分鐘。